转录因子TDF1对拟南芥雄性不育突变体atms1的温敏调控机制研究

郑亚洁,高 贝,夏群芳,周树敏,张 卫

(上海大学 生命科学学院 上海市能源作物育种及应用重点实验室,上海 200444)

在拟南芥的花药发育过程中,已知有一些转录因子在调控中起到决定性的作用[1]：如bHLH家族的转录因子,MYB家族的转录因子等[2].其中MYB家族的转录因子如：TDF1[3-5](TAPETAL DEVELOPMENTAND FUNCTION1)编码的是MYB-R2R3家族的转录因子.它主要在绒毡层以及小孢子母细胞中表达,突变体中因绒毡层发育异常,导致胼胝质无法降解,使得小孢子聚集在花粉囊中,不能形成正常的花粉粒,最终引起雄性不育表型.

本实验室在前期的研究中得到了1株在非胁迫温度范围内花粉育性受温度显著影响的拟南芥温敏雄性不育突变体atms1[6].在16 ℃时,该突变体育性与野生型相似,花粉全部可育；但随温度的升高,育性逐渐下降,到23 ℃时,突变体花粉有一半表现为不育；而到27℃时,突变体花粉则全部不育.经过对突变基因的图位克隆,发现该突变体在AT1G62940基因上的第四外显子202 bp处发生点突变,由“G”变为“A”(图1～2),ATMS1编码的蛋白第398个氨基酸由野生型的甘氨酸变为天冬氨酸.

图1 AT1G62940基因上的第四外显子上发生点突变

本实验就是通过在拟南芥atms1突变体中过量表达TDF1反义RNA,结合对atms1温敏雄性不育表型的分析,拟从遗传分子水平初步探究其中的作用机制.

1 材料与方法

1.1 材 料

Col-0生态型拟南芥(Arabidopsisthaliana)及atms1温敏雄性不育突变体种子由本实验室提供.

图2 ATMS1 CDS序列上的突变位点

菌株DH5ɑ(E.Coli)和GV3101(Agrobacteriumtumefaciens)为本实验室自制感受态细胞并保存；载体pCAMBIA-1300为本实验室所有并改造后使用；载体pMD18-T、DNA Marker、各种限制性内切酶、T4连接酶均购自TaKaRa公司.

1.2 方 法

1.2.1 植物cDNA的提取

Col野生型拟南芥23 ℃条件下培养,待其抽薹后,取花序,迅速置于液氮中,Trizol法提取RNA,反转录得cDNA,Trizol等试剂及cDNA反转录试剂盒均购自TaKaRa公司.

1.2.2 引物设计及TDF1基因片段的克隆

自www.arabidopsis.org网站上下载TDF1的CDS序列,大小为954 bp.根据CDS序列设计引物,上下游引物两端分别添加SalI和XbaI酶切位点.引物由上海生工生物工程公司进行合成.

引物序列为: 上游F(SalI) 5′-GCGTCGACATGGGAAGACCTCCTTGTT-3′,

下游R(XbaI) 5′-CGTCTAGACTAATAATCGAAATCATTCAAGAG-3′.

采用PCR方法对目的序列进行扩增,扩增采用TaKaRa公司生产的KOD PCR扩增试剂盒.

扩增条件参数为:

由高保真聚合酶扩增得到的PCR产物割胶回收后,加PolyA并纯化,与pMD18-T载体连接,得到pMD18-T-TDF1.采用热激法将重构的T质粒转化到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中进行扩增,重组T质粒经酶切鉴定正确后送往上海美吉公司进行测序.

1.2.3 表达载体构建

图3为本实验室改造后的pCAMBIA-1300质粒图谱.首先,将p1300质粒用SalI、XbaI进行酶切并回收质粒片段.然后从pMD18-T载体上切取测序正确的带有SalI、XbaI酶切位点的TDF1 CDS片段,回收后连入p1300质粒中,并将重组质粒转化大肠杆菌进行筛选和鉴定.

图3 p1300 质粒多克隆位点示意图

1.2.4 农杆菌的转化与鉴定

采用热激法将重组质粒p35S:TDF1(-)转化到根癌农杆菌GV3101中.在含有Rifa,Kana和Gen三重抗性的YEP固体培养基上进行筛选,挑取单菌落进行PCR检测.将鉴定正确的菌落接种到YEP液体培养基中进行扩增培养,利用浸染法[7-9]转化拟南芥atms1杂合子植株,收取T0代种子.

1.2.5 阳性苗筛选及鉴定

用50 μg/mL潮霉素B(Hygromycin B)对转化的T0代种子进行筛选,待抗性板上长出阳性苗后,将其移入土中生长.直至抽薹后,取2～3片叶子,用Edwards一步抽提法提取植株基因组DNA,进行遗传背景鉴定.

引物序列为: 与突变体匹配上游F(M):5′-AGCCAATGTGTAATGCAAGA-3′,与WT匹配上游F(WT):5′-AGCCAATGTGTAATGCAAGG-3′,通用下游R:5′-TGGACGGCTCTAACCTTC-3′.

扩增条件参数为:

1.2.6 花药育性观察

将阳性植株置于23 ℃的培养间生长,待其抽薹后,分两组分别放到16、27 ℃的人工气候培养箱中培养,2 d后重新置于23 ℃培养间中生长,取温度处理时处于花药发育第八期的花,用亚历山大染色法处理后,观察花粉育性.

1.2.7 过量表达植株Real-time PCR检测

常温培养拟南芥atms1突变体和p35S:TDF1(-)转基因植物,抽薹后平均分成两组,分别移至16和27 ℃处理24 h后,取花序,抽提RNA反转录成cDNA,以此为模板进行荧光定量PCR的检测,选用的仪器是BIORAD IQ5,管家基因UBQ10作为内参,反应体系为20 μL,如下：

SYBR Primix Ex Taq (2×) 10 μL

F primer (10×) 0.4 μL

R primer (10×) 0.4 μL

DNA 模板 2 μL

ddH2O 7.2 μL

TOTAL 20 μL

Real-time PCR 扩增条件参数为：

95 ℃ 30 s

表1 Real-time PCR 所用引物

2 结果与分析

2.1 目的片段过量表达载体构建

根据合成引物的退火温度,设计温度梯度测试,得到最佳退火温度为58 ℃,然后进行PCR扩增,得到970 bp左右的目的条带(图4).目的片段连入pMD18-T质粒,经扩增、筛选和鉴定后进行测序,在NCBI网站上对测序结果进行比对分析,显示匹配率100%；将目的片段连入pCAMBIA-1300质粒,构建成p35S:TDF1(-)过量表达载体,用XbaI、SalI酶对重组质粒进行酶切,得到约970 bp的条带及剩余载体条带(图5),以上结果说明正确的目的基因被成功连入了pCAMBIA-1300质粒,构建成了反义RNA载体.

1:扩增产物条带;M：分子marker图4 TDF1 CDS扩增

1、2:p35S:TDF1(-) 过表达质粒载体;M:分子marker图5 p35S:TDF1(-) 表达载体的酶切鉴定

2.2 转基因植株的鉴定

转基因鉴定采用扩增TDF1 CDS全长的引物,阳性苗中会扩增出2个条带,分别约为1230、970 bp,前者为TDF1的Genomic序列,后者为TDF1的CDS序列,为目的条带.atms1背景鉴定采用实验室已有SNP引物(图2),目的片段大小为523 bp,即：若使用F(M)/R、F(WT)/R引物同时PCR转基因植株的基因组DNA,只有F(M)/R扩增出目的条带,则该植株为atms1突变体纯合子；若只有F(WT)/R引物能够扩增出目的条带,则该植株为野生型；若两对引物都能扩增出条带,则该转基因植株背景为atms1杂合子.对12株阳性苗基因组进行PCR鉴定,显示其中9株为转基因植株,分别为1、2、3、4、5、6、8、9、10号(图6),然后再将这9株植物进行atms1背景的鉴定,结果显示转基因植株1、2、3、4、5、8、9、10号为atms1杂合子,6号为野生型(图7).

1～12:阳性苗;+:阳性对照;M:分子marker图6 转基因植物PCR鉴定

1～6、8～10：转基因阳性苗;F(M)R:突变体基因扩增引物;F(WT)/R:野生型基因扩增引物图7 转基因植物atmsl背景鉴定

2.3 花药育性观察

将鉴定后1、2、3号阳性苗进行传代,在T3代植株中筛选获得既是转基因纯合子又是atms1纯合子背景的植株.通过温度处理后,对花粉育性进行观察.结果显示：atms1突变体在16 ℃时花粉粒饱满呈红色,育性良好(图8A)；27℃时花药中的花粉粒呈绿色,且降解呈碎片状,表现为完全不育(图8B)；而转基因atms1植株的花药花粉在16、27 ℃时育性都得到恢复(图8C、D).

A、B：atms1突变体16、27 ℃处理的花药;C、D：p35S:TDF1(-)转基因atms1植株16、27 ℃处理的花药(Bars为20 μm)图8 不同温度下转基因植物的花粉亚历山大染色

2.4 Real-time PCR

温度处理后的atms1突变体和转基因植物经Real-time PCR检测结果显示(图9)：atms1突变体中TDF1的表达量16 ℃处理组远高于27 ℃处理组；而在p35S:TDF1(-)转基因atms1中,16、27 ℃组TDF1的表达量与16 ℃atms1相比明显下降,说明转基因植株中TDF1的转录水平受到明显下调,但是与atms1突变体27℃的表达量比较,总体水平还是略有增加.另外,ATMS1m表达量在atms1中呈现16 ℃处理组高于27 ℃处理组,约为27 ℃处理组的5倍,而在p35S:TDF1(-)转基因atms1中ATMS1m的表达量在16 ℃和27 ℃时都较atms1突变体27 ℃时有所增加,这说明ATMS1m的表达量的上升对于突变体atms1育性的恢复有积极的作用.

A:p35S :TDF1 (-) 转基因植株和 atms1突变体中,TDF1的表达; B：p35S :TDF1 (-) 转基因植株和 atms1突变体中,ATMS1m的表达图9 p35S:TDF1(-)转基因植物和atms1中TDF1、ATMS1m的转录表达

3 讨 论

ATMS1是目前已知的第一个在非胁迫温度变化范围内直接影响拟南芥雄性不育性状的基因.在atms1突变体中,16 ℃时ATMS1mmRNA的积累量明显高于27 ℃的积累量,表明转录水平上的变化可能导致了该突变体育性随温度不同而发生变化,即:27 ℃时花药完全不育,23 ℃时呈现部分不育,16 ℃时育性与野生型相同.

TDF1是MYB-R2R3家族的转录因子.它的突变体中胼胝质无法降解使得小孢子聚集在花粉囊中,表现为完全不育[10].通过在atms1突变体中导入用于降低TDF1转录水平的反义RNA表达载体,发现在p35S:TDF1(-)转基因植株中TDF1的表达量明显下降,约为atms1突变体16 ℃时的四分之一,表明p35S:TDF1(-)这个反义RNA表达载体在拟南芥体内有效地抑制了TDF1的表达.但这种抑制作用还不足以使转基因植物表现出tdf1突变体的表型[10]；Real-time PCR的结果显示p35S:TDF1(-)反义RNA虽然抑制了TDF1的表达,但与atms1突变体在27 ℃的情况比较,TDF1的表达量还是有所提高的,反应到ATMS1m的表达水平上就更加明显,p35S:TDF1(-)转基因atms1中不论16 ℃还是27 ℃,ATMS1m的表达水平都高于atms1突变体在27 ℃的水平.这提示在拟南芥体内ATMS1m的表达量可能存在一个阈值,低于此阈值时,植株表现为完全不育,高于此阈值时,对植株育性的影响较小.而TDF1又正调控于ATMS1m的表达；当TDF1表达受抑制时,ATMS1m的表达量也会减少,但只有当ATMS1m表达量低于一定阈值时,花粉的育性才会受到显著影响.而这个阈值可能就是ATMS1m在27 ℃的表达水平.因此,本研究认为TDF1对ATMS1m具有一定的正向调控作用,通过ATMS1m表达水平的变化最终影响花粉育性的变化,而对于其中更深入的调控机制则有待于进一步的研究.

参考文献:

[1] 陈丽.植物转录因子的结构与功能[J].植物生理学通讯,1997,33(6):401-409.

[2] JIN H L,CATHIE M.Multifunctionality and diversity within the Plant MYB-gene family [J].Plant Mol Biol,1999(41):577-585.

[3] ZHU J,CHEN H,YANG Z N.Defective in Tapetal development and function 1 is essential for anther development and tapetal function for microspore maturation in Arabidopsis [J].Plant J,2008,55(2):266-277.

[4] ZHANG W,SUN Y,TIMOFEJEVA L,et al.Regulation of Arabidopsis tapetum development and function byDYSFUNCTIONALTAPETUM1 (DYT1) encoding a putative bHLH transcription factor [J].Development,2006,133(16):3085-3095.

[5] YANHUI C,XIAOYUAN Y,KUN H,et al.The MYB transcription factor superfamily of Arabidopsis: expression analysis and phylogenetic comparison with the rice MYB family [J].Plant Mol Biol,2006,60(1):107-124.

[6] 戴文懿,孙亚梅,高贝,等.拟南芥温敏雄性不育突变体atms1 的获得及表型分析[J].上海大学学报,2011,17(5):681-686.

[7] 樊荣,万小荣,张文涛,等.LE-ACS6 启动子在LE-ACS6: :GUS转基因拟南芥中的特异性[J].植物生理与分子生物学学报,2004,30(3):351-358.

[8] 张秀春,李文彬,夏亦荠,等.AtNUDT8过量表达的拟南芥转基因植株[J].热带生物学报,2010,1(1): 9-10.

[9] 张好富,张宪银.一种不依赖于无菌培养的拟南芥活体转基因种子筛选方法[J].浙江大学学报:农业与生命科学版,2009,35(4):372-376.

[10] 陈辉.拟南芥雄性不育突变体tdf1的基因克隆和功能分析[D].上海:上海师范大学,2007.