水蕨(Ceratopteris thalictroides)两条MADS-box基因的克隆与分析

徐道兰, 戴锡玲, 徐 颖, 王全喜

(上海师范大学 生命与环境科学学院,上海 200234)

0 引 言

植物花器官的发育受花同源异型基因的调控,其大部分成员都属于MADS-box基因家族[1].MADS-box基因在植物生长发育过程中起着非常重要的作用,除了决定花器官特异性、开花时间和花芽的形成[2-5],还能够调控植物的营养生长,如:果实形成[6-7]、种子色素沉积、内皮发育[8]和根发育[9]等.MADS-box基因家族成员根据序列结构特征分为2种类型;Ⅰ型和Ⅱ型,这2种类型的基因可能是在大约10亿年前通过发生在植物和动物分化之前的一次基因复制产生的[10]. 植物Ⅰ型MADS-box基因通常含有1～2个外显子,编码的蛋白含有一个高度保守的SRF-like MADS域,但缺少K域.植物Ⅱ型MADS-box基因是多内含子和外显子结构,根据结构和序列差异进一步分为MIKCc型和MIKC*型[11].该类基因编码的蛋白主要由4部分组成:MADS域、I域、K域、C域[12].MADS域主要参与结合DNA蛋白质二聚化以及其他因子的功能[13].I域可以促进二聚体的转录因子与DNA结合[12,14].K域参与介导蛋白-蛋白双螺旋的形成,从而促进二聚化的发生[13,15].C域末端的变化较大,但不同类的MADS-box基因常含有一些保守的基序,这些基序在蛋白复合体的形成和转录激活中起重要作用[16].

现今许多开花植物MADS-box基因的功能已进行广泛而深入的研究,但对于非开花植物,该基因家族的研究还处于初步阶段[17].为了探究缺少特异性花器官、拥有原始繁殖器官这类植物中MADS-box基因的功能,研究者们开始对苔藓、蕨类和拟蕨类植物MADS-box基因进行探究[1,18-21].蕨类和拟蕨类,作为植物进化系统中的过渡类群,拥有一些区别于种子植物的原始特征[21].为了理解MADS-box基因随着植物的进化自身的结构和功能发生了怎样的改变,一些蕨类植物,如水蕨(Ceratopterisrichardii)、瓶儿小草(Ophioglossum)、江南卷柏(Selaginellamoellendorfii)、疏叶卷柏(Selagnellaremotifolia)中MADS-box基因已被克隆出来并用于进化分析[1, 19-21].本文作者选取水蕨属(Ceratopteris)水蕨(Ceratopteristhalictroides)作为材料,以植物(尤其是蕨类植物)中已克隆出来的MADS-box基因作为参考,对水蕨(Ceratopteristhalictroides)MADS-box基因进行克隆,并与其他物种中的MADS-box基因进行结构特征的比较,分析该基因序列结构的变化,通过进化树的构建补充完善植物MADS-box基因的进化图谱.本研究的结果为蕨类植物的系统进化研究提供了参考和基础资料.同时,也为MADS-box基因的进化和功能研究积累了资料.

1 材料和方法

1.1 植物材料与培养

本研究所用的植物材料为水蕨(Ceratopteristhalictroides)配子体.水蕨孢子从成熟孢子体上收集,接种于MS培养基上后,置于相对湿度为75%、昼夜温度为26 /22 ℃的人工培养箱中培养21 d左右,收集其幼嫩配子体材料.

1.2 RNA 提取和cDNA 合成

收集的水蕨配子体材料于液氮中研磨至细粉状,总RNA的提取参照康为世纪植物RNA提取试剂盒操作步骤.提取出来的总RNA加入去DNA酶(TaKaRa),37 ℃ 30 min处理以去除其中的DNA杂质.提取的RNA 通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计进行完整度和纯度的检测.所有的检测结果显示所提取的总RNA完整且纯度较高(1.8

cDNA的合成使用SuperscriptⅢ反转录试剂盒(Invitrogen),接头引物为T17AP引物 (5′-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3′).

1.3 PCR扩增CtMADS1和CtMADS2基因的核心片段

根据NCBI数据库中已发表的水蕨(Ceratopterisrichardii)MADS-box基因设计两对特异性引物.上游引物:MADS1a (5′-CGGTCCGACGCATTTCTA-3′)和MADS1b(5′-TTCTTTCCGCAGATTAGTT-3′).下游引物: MADS2a(5′-TCCTGCCTTCCGCTTTGA-3′)和MADS2b(5′-CCACATTATCCGTTGAGC-3′).PCR扩增体系为50 μL:1 μL cDNA、0.2 μmol·L-1引物、1×LA PCR buffer(Mg2+plus)、 2.5 mmol·L-1dNTPs和2.5 U LA Taq聚合酶.PCR反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃终延伸10 min.PCR产物用1%含有溴化乙锭(EB)的琼脂糖凝胶进行电泳检测.将含有目的条带的片段进行纯化,连接pEASY-T5载体(Trans)、转化到大肠杆菌感受态细胞中,挑取的单克隆LB培养基中摇床37 ℃培养14～16 h后,菌液送华大公司测序.

1.4 RACE技术获得CtMADS1和CtMADS2基因的3′和5′端

3′-RACE采用Clontech公司的SMARTer RACE cDNA 扩增试剂盒,具体步骤参照说明书.设计的两对内部特异性引物分别为:CtMADS1F1(5′-AAGTTACAATCAACCGCCTCC-3′),CtMADS1F2(5′-GCAGGTGACATATTCAAAGCG-3′),CtMADS2F1(5′-GCATTCTTTCCGCAGATTAGTT-3′),CtMADS2F2(5′-CGCAATGGTGAGGAGGAAGAT-3′).PCR反应程序为:94 ℃预变性2 min ;94 ℃变性30 s,68 ℃退火30 s,72 ℃延伸3 min,25个循环;72 ℃终延伸9 min.5′-RACE参照Invitrogen公司的5′-RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0试剂盒的说明书进行.设计的两对内部特异性引物分别为:CtMADS1R1(5′-GGCGGTTGATTGTAACTTGTTT-3′),CtMADS1R2(5′-GCTTTGAATATGTCACCTGCT-3′),CtMADS2R1(5′-CTTGATCTTCCTCCTCACCATT-3′),CtMADS2R2(5′-CTTATCCACATTATCCGTTGAGC-3′).PCR反应程序为:94 ℃预变性2 min ;94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,35个循环;72 ℃终延伸7 min.PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测.将含有目的片段纯化、连接pEASY-Blunt载体(Trans)、转化后,菌液送华大公司测序.

1.5 CtMADS1和CtMADS2基因ORF扩增

CtMADS1和CtMADS2基因的ORF扩增分别采用的是两对特异性引物P1(5′-ATGGGGAGAGTGAAGTTGGCG-3′)和P2(5′-TTAAGTATTGTCATTGAACCATG-3′), P3(5′-ATGGTGAGGAGGAAGATCAAG-3′) 和P4(5′-CTACTCAGAGGCAGGTGATTCAT-3′) .PCR扩增体系为50 μL:2 μL cDNA、0.3μmol·L-1specific primers、1×PCR buffer、1.5 mmol·L-1MgSO4、2 mmol·L-1dNTPs和1 U KOD 聚合酶.PCR反应程序为:94 ℃预变性2 min;98 ℃变性10 s,55 ℃退火30 s,68 ℃延伸30 s,35个循环;68 ℃终延伸7 min.PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测.将含有目的片段纯化、连接pEASY-Blunt载体(Trans)、转化后,菌液送华大公司测序.

1.6 序列同源性比较和系统进化分析

MADS-box蛋白序列的比对采用默认参数的ClustalX软件[22],并进行一些相应的调整,从而探究水蕨(Ceratopteristhalictroides)MADS-box蛋白序列与水蕨(Ceratopterisrichardii)以及其他物种中MADS-box蛋白的序列差异.进化树的构建采用MEGA5.2[23]软件的maximum likehood (ML)方法,参数设置如下:Kimura 2-parameter model,complete deletion和bootstrap(1000 replicates)[24],将其蛋白序列与GenBank数据库已登录的其他物种MADS-box蛋白序列用ClustalW法进行比对后生成系统发育树.

2 结 果

2.1 基因全长的克隆

通过3′和5′RACE获得2条水蕨(Ceratopteristhalictroides)MADS-box基因cDNAs全长序列,CtMADS1和CtMADS2(图1,2).CtMADS1全长1162 bp,CtMADS2全长1314 bp(图3,4).CtMADS1和CtMADS2的起始密码子分别位于距N端281 bp和282 bp处.CtMADS1和CtMADS2与其他典型的MIKCc和MIKC*型基因比较结果显示:CtMADS1属于典型的MIKC*型MADS-box基因,拥有延伸的I域,而CtMADS2属于典型的MIKCc型,缺少延伸的I域(图5).

A:核心片段的扩增; B:3′ RACE扩增; C:5′RACE扩增; D:ORF扩增; M:DL 2000 Marker; 1:核心片段的扩增产物; 2:3′ RACE的扩增产物;3:5′ RACE的扩增产物; 4:P1和P2的扩增产物图1 CtMADS1基因片段的凝胶电泳分析

与已经报道的水蕨(Ceratopterisrichardii)MADS-box序列进行比较分析,CtMADS1与其M16高度相似,而 CtMADS2 与其CMADS3同源性较高.然而,其中还是存在一些差异,可能不能被当作同一基因.当然,这还需要更多的证据去证明.

2.2 序列同源性比较和系统进化分析

现今的系统进化研究已揭示了MADS-box基因家族的主要分支.为了确定水蕨(Ceratopteristhalictroides)MADS-box基因与其他物种MADS-box基因的进化关系,将得到的2条MADS-box基因与来自于部分苔藓、蕨类、裸子和被子植物中MADS-box基因构建无根ML 进化树(图6).结果显示选取的70条MADS-box基因可以分为2种类型,MIKCc和MIKC*型,这与之前的系统进化树一致.对于本实验克隆得到的2条水蕨(Ceratopteristhalictroides)MADS-box 基因,系统进化分析也支持CtMADS1属于MIKC*型, CtMADS2 属于MIKCc型.

A:核心片段的扩增; B:3′ RACE扩增; C:5′RACE扩增; D:ORF扩增; M:DL 2000 Marker; 1:核心片段的扩增产物; 2:3′ RACE的扩增产物; 3:5′ RACE的扩增产物; 4:P3和P4的扩增产物图2 CtMADS2基因片段的凝胶电泳分析

图3 CtMADS1的核苷酸和氨基酸序列下划线部分为MADS域和K域

图4 CtMADS2的核苷酸和氨基酸序列(下划线部分为MADS域和K域)

MADS域和K域均以单下划线标记.CMADS3 和M16来自于水蕨(Ceratopterisrichardii),LAMB2和LAMB4来自于石松(Lycopodium),AGAMOUS和 APETALA1来自于拟南芥(Arabidopsisthaliana),PPM3和PPM4来自于小立碗藓(Physcomitrella).其中,CMADS3、M16、LAMB2、LAMB4、AGAMOUS和APETALA1是典型的MIKCc型,PPM3和PPM4是典型的MIKC*型.

除此之外,系统进化分析还揭示了水蕨属的MADS-box基因组成3个不同的族,散布在种子植物的MADS-box基因家族中;研究者推测蕨类植物与种子植物共同祖先的MADS-box基因经过多次独立复制产生目前数目繁多的MIKC型基因,从而产生现存的蕨类植物与种子植物.

3 讨 论

本研究克隆得到的2条水蕨(Ceratopteristhalictroides)MADS-box基因丰富了MADS-box基因家族.比对结果表明这2条CtMADSs与其他物种MADS-box基因无论在核苷酸还是氨基酸序列上都有一些差异.根据系统进化树的分析,CtMADS1属于MIKC*分支,与水蕨(Ceratopterisrichardii)M16和M13,小立碗藓(Physcomitrellapatens)PpMADS2、PpMADS3、PPM3和PPM4 同源性较高.CtMADS2属于MIKCc分支,与水蕨(Ceratopterisrichardii)CMADS3和CMADS4,石松(Lycopodium)LAMB2、LAMB4和LAMB6[20,25]同源性较高.

然而,系统进化关系再建并没有为蕨类植物MADS-box基因的功能研究提供明确的线索.Northern和原位杂交手段已经探索出一些水蕨属MADS-box基因的表达[20,26].结果显示:其大多数MADS-box基因在其完整的生活史,即孢子体和配子体中均有表达.这种表达模式和种子植物中MADS-box基因特异性表达于特定器官不同[27].这可能对于植物的进化非常重要.本研究因此假设蕨类植物,没有花器官,已经拥有至少一种MIKC型MADS-box基因.这些基因不是花器官决定基因,但在控制发育和细胞分化等方面具有更广泛的功能.伴随着植物的进化,MADS-box基因的器官特异性表达模式导致了现存开花植物的产生.当然,这还需要更多蕨类植物MADS-box基因功能方面的研究来补充完善对这个家族的猜想,这同时也是后续研究计划.

图5 克隆的水蕨(Ceratopteris thalictroides)CtMADSs蛋白序列与部分苔藓、蕨类和被子植物MADS-box蛋白的多序列比对

图6 MIKC型MADS-box基因的ML树分析自展支持率显示在各分支上(分支长度正比于估计的进化距离,物种名称显示在各分支MADS-box基因同系物的后面括号里)

然而,对于完全理解MADS-box基因在植物进化过程中所扮演的角色还有很长的路要走.相比较于种子植物,至今对于非开花植物中的苔藓和蕨类植物这类陆地植物进化过程中非常重要部分的MADS-box基因知之甚微.

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