玻璃酸钠对骨关节炎患者膝关节液中miR-140表达的影响

张明，王铁军，刘书茂，黄东明，李辉，高飞，李悦，杜尧

(1.北京市大兴区人民医院骨科，北京 102600；2.中南大学湘雅二医院创伤骨科研究室，湖南 长沙 410011)

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种常见的慢性退行性关节疾病。其主要病变特征是细胞外基质合成不足导致的关节软骨退变、继发的骨赘形成和累及滑膜。女性的发病率高于男性。其发生率随年龄的增长而升高，据统计我国50 岁以上人口发病率为5%，膝关节骨关节炎的发病率为9.56%；60 岁以上人口发病率为20%，其中膝关节骨关节炎发病率占49%[1]。其发病机制与多种因素相关，但尚无确切的机制。我们前期的研究结果表明骨关节炎患者膝关节液中微小RNA-140(micro RNA-140，miR-140)的表达是下调的，且与骨关节炎的严重程度呈负相关[2]。本研究旨在检测玻璃酸钠注射液治疗骨关节炎前后miR-140的表达、膝关节HSS评分变化，探讨miR-140在骨关节炎发病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 患者 按照美国风湿病学会(American rheumatism association，ARA)制定的诊断标准[3]，选取不同Kellgren-Lawrence分级骨关节炎患者，Ⅰ级组治疗前后各10 例、Ⅱ级组治疗前后各10 例、Ⅲ级组治疗前后各10 例、Ⅳ级组治疗前后各10 例，最小年龄38 岁，最大年龄90 岁，平均年龄62.1 岁，男性15 例，女性25 例。所有实验对象均来自于中南大学湘雅二医院创伤骨科研究室，行玻璃酸钠膝关节腔注射治疗，治疗前抽取关节液，一次2 mL，1周1次，5周一疗程，治疗后1周抽取关节液，置于15 mL无菌、无酶的离心管中备用。同时对每个患者治疗前后行HSS评分。本研究方案得到了中南大学伦理学委员会认可，全部标本收集于2010年6月至2010年12月。

1.2 材料 玻璃酸钠注射液(施沛特)为山东博士伦福瑞达制药有限公司提供。PCR热循环仪购自美国Applied Biosystems公司(型号：2700)；实时荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司(型号：StepOneTM)。TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit购自美国Applied Biosystems公司。TaqMan MicroRNA Assays试剂盒购自美国Applied Biosystems公司。TaqMan 2×Universal PCR Master Mix Ⅱ(no UNG)购自美国Applied Biosystems公司。

1.3 方法 采用HSS膝关节功能评分表对所有研究对象进行评分。采用Trizol一步法提取Total-RNA(裂解、分层、RNA沉淀、RNA洗涤和RNA溶解)。反转录合成cDNA，反应体系见表1，反应条件(16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min)，选择OD260/280值在1.6～2.1之间的Total-RNA标本，每次反应Total-RNA量为100 ng。实时荧光定量PCR检测miR-140和U6snRNA，反应体系见表2，反应条件(95℃ 10 min，95℃ 15 s及60℃ 1 min)，后2步共50个循环。在相对定量分析中，荧光定量PCR的结果以Ct值显示。用2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量[4]。

1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0软件对所有数据进行统计学分析。治疗前后的样本PCR检测结果应用独立样本配对t检验进行分析，组间比较采用ANOVA方差分析，检验水准取α=0.05。OA严重程度与治疗前后miR-140表达水平变化之间的关系采用Spearman等级相关秩检验。

表1 反转录反应体系成分及体积

表2 实时荧光定量PCR反应体系的成分及体积

2 结 果

2.1 治疗前后HSS评分、miR-140表达水平结果 与治疗前相比，HSS评分升高，miR-140在骨关节炎患者膝关节液中的表达水平上调。Ⅰ级组、Ⅱ级组、Ⅲ级组治疗前后HSS评分、miR-140表达水平差异有统计学意义(P<0.05)，Ⅳ级组治疗前后HSS评分、miR-140表达水平差异无统计学意义(P>0.05)(见图1～2)。

图1 治疗前后HSS评分比较

2.2 组间比较及相关性分析 Ⅳ级组HSS评分、miR-140的表达改变与Ⅰ级组、Ⅱ级组、Ⅲ级组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；骨关节炎的不同分级与miR-140的表达改变呈负相关(r=-0.825，P<0.05)。

3 讨 论

骨关节炎又称退行性关节炎，可分为原发性和继发性。原发性骨关节炎的发病机制尚不清楚，可能与高龄、女性、肥胖、职业性过度使用等因素有关；继发性骨关节炎与代谢异常、机械性或解剖学异常、内分泌异常、炎症性关节疾患、神经性缺陷等因素有关。OA的主要临床特点是：关节疼痛、肿胀、畸形、功能受限，好发于膝关节，很难逆转，治疗困难。病理特征：a)关节软骨软化，弹性降低，纤维变性，可有碎裂、剥脱、软骨下骨质外露；b)滑膜大量增殖、水肿；c)软骨下骨增生，骨小梁增粗；d)关节囊可发生纤维变性和增厚，限制关节活动，周围肌肉发生保护性痉挛，出现关节畸形。其发病机制迄今为止尚不完全清楚，可能是多种因素共同作用的结果。OA严重影响人们的生活质量，给社会及家庭带来沉重负担，所以研究其发病机制及有效的治疗方法具有十分重要的价值。

图2 治疗前后miR-140相对表达量的比较

玻璃酸是一种线形酸性粘多糖，由N-乙酰葡糖胺和葡糖醛酸二糖单位反复联接组成，在关节内由滑膜B细胞分泌，是关节滑液和软骨基质内的重要成分[5]。玻璃酸钠的主要生理功能有：a)参与细胞外液中电解质和水分的调节；b)关节和细胞间润滑作用；c)与蛋白糖亚单位结合构成蛋白多糖聚合物，组成软骨基质；d)透明质酸钠还可通过修复生理屏障、分子筛作用、促进自身玻璃酸钠合成、稳定痛觉感受等作用治疗OA。玻璃酸钠能增强关节液粘稠性和润滑功能，进入软骨基质与糖蛋白结合，促进软骨愈合和再生；改善滑液组织的炎症反应，降低血清与滑膜液中IL-1、IL-6水平，抑制免疫损害进程并缓解疼痛[6]。1974年，Peyron和Balazs首次用玻璃酸钠治疗26 例OA患者，取得了良好的效果[7]。进入21世纪以来，国内、外大量研究证实玻璃酸钠对膝OA的近期及远期疗效是肯定的，2000年美国风湿病学会(ACR)把玻璃酸钠写入髋、膝OA治疗指南[8]。玻璃酸钠治疗OA，能够向患者补充外源性的玻璃酸钠，提高关节液内玻璃酸钠的含量，使软骨表面形成自然屏障，减轻或消除了关节的摩擦，改善了滑膜的生物学功能，恢复和稳定关节内环境，重建膝OA关节内已被打乱的平衡系统[9]。本研究表明玻璃酸钠治疗轻、中度膝OA疗效明显，而对重度膝OA疗效不明显。

miRNA是一类内生的小RNA，长度约19～25个核苷酸组成，是发夹结构的单链RNA，大约有70～90个碱基对，由前体经过Dicer酶加工后生成。它们不参与蛋白质的编码，但是可以调节基因的表达，一个miRNA可以调控多个基因的表达，几个miRNAs也可以共同精细调控一个基因的表达。MiR-140是micRNAs家族中的成员之一。2006年Tuddenham等[10]通过小鼠胚胎研究miRNA-140在骨关节炎的发病过程中的作用，实验方法包括DNA的构建、原位杂交、质粒转染、荧光素酶分析，结果显示小鼠胚胎发育过程中miR-140在很多软骨组织(如颅骨、四肢骨、肋骨、胸骨的软骨部分)当中特异性表达，并且证明miR-140潜在的靶基因是组蛋白去乙酰化酶-4。2007年Johann等[11]研究发现在斑马鱼腭的发育过程中，miR-140基因可以负性调节血小板衍生生长因子(Platelet Derived Growth Factor，简称Pdgf)信号途径，在Pdgf受体蛋白水平，Pdgf受体当中包含负性调节作用的miR-140结合位点，表明miR-140与软骨的发育有关。有研究结果发现miR-140具有软骨细胞分化相关的表达模型，miR-140在软骨发育和体内平衡过程中发挥关键作用。2010年Miyaki等[12]通过敲除miR-140目标基因，建立老鼠动物实验模型，研究结果显示miR-140可以调节软骨的发育，miR-140缺失导致了蛋白多糖的丢失和关节软骨的纤维化，符合年龄相关的OA样改变。我们研究小组在2011年采用实时荧光定量的PCR检测miR-140，研究表明人膝关节液中有miR-140表达，在OA患者表达是下调的，且与OA严重程度呈负相关[2]。

本研究证实玻璃酸钠治疗OA是有效的，同时miR-140表达与治疗前相比是上调的，且与OA严重程度呈负相关。说明miR-140可能在OA的发生、发展过程中起着重要作用。为进一步研究miR-140在OA发病机制中的作用奠定理论基础。通过本研究尚未确定OA与miR-140之间的因果关系，在我们后续研究中需要通过动物实验、下游靶基因调控进一步证实。

参考文献：

[1]张乃峥，施全胜，张雪哲，等.膝骨关节炎的流行病学调查[J].中华内科杂志，1995，34(2)：84-87.

[2]张明，刘立宏，肖涛，等.实时荧光定量的PCR检测骨关节炎患者膝关节液中miR-140的表达[J].中南大学学报(医学版)，2012，37(12)：1210-1214.

[3]Mandell BF，Lipani J.Refractory osteoarthritis.Differential diagnoses and therapy[J].Rheum Dis Clin North Am，1995，21(1)：163-178.

[4]Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method[J].Methods，2001，25(4)：402-408.

[5]Bermardeau C，Bucki B，Liote F.Acute arthritis after intrarticular hyaluronate injection：onset of effusions without crystal[J].AnnRheum Dis，2001，60(5)：518-520.

[6]Wisnieskih G，Naime D，Hua JC，etal.TSG-6，a glycoprotein associated with arthritis，and it s ligand hyaluronan exert opposite effect in a murine model of inflammation[J].Pflugers Arch，1996，431(6 Suppl 2)：R225-R226.

[7]Peyron JG，Balazs EA.Preliminary clinical assessment of Ne-hyaluronate injection into human arthritic joints[J].Pathol Biol，1974，22(8)：731-736.

[8]American college of Rheumatology Subcommittee on Osteoarthritis.Recommendations for the medical man-agement of osteoarthritis of the hehipand knee[J].Arthritis Rheum，2000，43(9)：1905-1915.

[9]Marshall KW.Viscosupple men tation for osteoarthritis.Current status unresolve，and fenturedireetion[J].Rheamatol，1998，25(1)：2056-2058.

[10]Tuddenham L，Wheeler G，Ntounia-Fousara S，etal.The cartilage specific microRNA-140 targets histone deacetylase 4 in mouse cells[J].FEBS Letters，2006，580(17)：4214-4217.

[11]Johann K Eberhart，Xinjun He，Mary E Swartz，etal.MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis[J].Nature Genetics，2008，40(3)：290-298.

[12]Miyaki S，Sato T，Inoue A，etal.MicroRNA-140 plays dual roles in both cartilage development and homeostasis[J].Genes Dev，2010，24(21)：1173-1185.