鸡感染多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌的分离鉴定

朱贵霞 杨树美 （山东省蒙阴县畜牧局 276200）

巴氏杆菌病(P.multocida)和大肠杆菌病(E.coli)是危害养禽业的两大细菌性传染病，由特定血清型的致病菌引起[1]。鸡群感染两种细菌时均可引起严重下痢和败血性症状，若两菌同时感染时其致病力会大大加强，更易引起鸡群呈急性败血性发病[2]。巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌引起的细菌性传染病，对禽类的致病性较强，又称为禽霍乱、禽出血性败血病，俗称为禽出败[3]。该病发生后，同种畜禽间能互相传染，不同的畜禽种间亦可交叉感染。本菌对多种家畜、家禽、野兽、野生水禽及人均有致病性。可使牛、水牛、羊、马等发生出血性败血症；使鸡、鸭、鹅等发生禽霍乱；使猪发生猪肺疫性肺炎等[4]。多杀性巴氏杆菌病分布广泛，世界各地均有发生[5]。大肠杆菌病是由大肠埃希氏菌的某些血清型引起的，血清型众多，对动物的致病性强弱也不等，临床表现复杂[6]。该病可引起鸡胚胎死亡，或雏鸡和幼鸡死亡率很高的败血症，以及脐炎、关节炎、眼球炎、出血性肠炎及大肠杆菌性肉芽肿等多种病型的疫病[7]。大肠杆菌病流行分布极为广泛和普遍，给养鸡业带来巨大的经济损失。 本研究通过对某地一鸡群病死鸡进行细菌的分离鉴定，并进行毒力试验和药敏试验，为该病的临床诊断和治疗提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 某鸡场病死鸡约650只，从青年鸡到雏鸡均有发病、死亡，死亡呈急性。

1.1.2 培养基 普通营养琼脂、营养肉汤、血清营养肉汤、麦康凯琼脂、鲜血营养琼脂培养基均按常规方法配制。

1.1.3 试验动物 健康小鼠24只，体重18～20g，购自聊城市动物疾病研究中心。1日龄健康雏鸡24只购自某种鸡场。

1.1.4 微量糖发酵管、抗原诊断因子血清 微量发酵管购自上海医学化验所试剂厂；大肠杆菌O抗原诊断因子血清购自中国兽医药品监察所。

1.1.5 药敏纸片 药敏纸片—四环素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、状观霉素、强力霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、单诺沙星、复方新诺明、羧苄青霉素、氨苄青霉素、磺胺异恶唑和头孢氨苄西林购自北京天坛药物生物技术开发公司。

1.2 方法

1.2.1 发病情况 某鸡场4300只鸡，分4批次，每群有1000余只鸡，从青年鸡到雏鸡不同日龄。青年鸡首先发病，其余3批随后也发病，发病数随时间呈递增状态，1周时间共死亡650只鸡；病鸡主要表现精神沉郁，羽毛杂乱蓬松，两翼下垂，缩颈低头，俯卧在地，不愿走动，离开群体独自闭目打盹，下痢，粪便稀呈绿白色；病程短，一般发病至死亡不超过24h。病死鸡剖检约有70%呈败血症状，广泛性出血，腹腔有大量黄色干酪样物质；肝脏肿大、充血、坏死；脾脏肿大、淤血、有坏死灶；胰脏有出血点、有坏死灶；心包积液，有炎症；肠道黏膜脱落、出血、坏死；腺胃、脑无异常。

1.2.2 分离病菌 无菌取病鸡的肝、脾和胰组织，分别接种于普通营养培养基、麦康凯琼脂、绵羊鲜血营养琼脂，分别置37℃培养箱和5%CO2的培养箱，恒温培养24h。

1.2.3 菌落形态及培养特性 取初次分离及纯培养的细菌涂片、染色、镜检，然后观察分离菌在不同培养基的生长情况及菌落情况。

1.2.4 生化反应及血清型鉴定 从每群鸡分离到的细菌中选取具有代表性的疑似大肠杆菌和疑似巴氏杆菌各2株，共16株纯培养物，分别编号为D1、D2……D8和B1、B2……B8。将纯培养菌分别接种于生化反应管和微量发酵管等，按常规生化试验进行，37℃培养一定时间。具体操作步骤按照《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版方法进行，按说明进行判定[8]。

1.2.5 增菌纯培养 对生化试验鉴定为大肠杆菌的菌株，无菌接种于普通营养琼脂培养基培养，置37℃培养箱20h。对生化试验鉴定为巴氏杆菌的菌株，无菌接种血液琼脂平板培养基培养，于5% CO2的培养箱培养20h。

1.2.6 药敏试验(纸片法) 以分离菌的液体培养物适当稀释接种培养基，用无菌尖头镊子夹取各种抗菌素药敏试纸片，按一定密度分别贴到已涂布细菌的培养基表面，倒置于37℃温箱内培养24h，分别测定抑菌圈的直径。

1.2.7 动物试验 用分离菌的肉汤培养物适当稀释大肠杆菌纯培养物、巴氏杆菌纯培养物、大肠杆菌纯培养物和巴氏杆菌纯培养物混合物及无菌肉汤制成菌悬液，接种试验动物。试验动物分4组，每组12只，皮下注射0.2ml/只。连续观察120h，记录发病及死亡情况和剖检死亡动物，同时取其肝脏触片，美蓝染色镜检。另采样接种培养基，37℃培养后，革兰氏染色，观察纯培养物。

1.2.8 大肠杆菌血清型试验 分离的菌种用营养肉汤培养基培养并经120℃2.5h处理后，与鉴定用大肠杆菌标准抗O因子血清(A-F群)做平板凝集试验，以鉴定其群别。H抗原一般不作鉴定。

2 结果与分析

2.1 分离培养和镜检

无菌分别接种普通营养琼脂、麦康凯和鲜血琼脂培养基，37℃培养，24h后观察。普通营养琼脂上只有一种菌落，呈圆形，微隆起，光滑，湿润，半透明或灰白色，边缘整齐，菌落直径2.5mm。麦康凯培养基中只见一种红色菌落，形态与上述菌落相似。鲜血培养基上有2种形态菌落，一种与上述菌落相似并且呈β溶血，每群鸡选取具有代表性的菌落2株，共8株菌落，编号为D1、D2……D8。革兰氏染色镜检均为G-杆菌。鲜血培养基上还有另一种菌落呈小水滴样，光滑透明，不溶血，菌落较小，培养48h后菌落变大一些，每群鸡选取具有代表性的菌落2株，共8株菌落，编号为B1、B2……B8。接种普通培养基均不生长，麦康凯培养基均不生长，革兰氏染色镜检均为G-杆菌，美蓝染色镜检，可见两极浓染小球杆菌。其纯培养菌落在光学显微镜45°荧光观察，呈桔红色。

2.2 生化鉴定

将分离的16株纯培养菌做生化反应试验，结果见表1和表2。

表1 D1-D8株分离菌生化特性反应结果

表2 B1-B8株分离菌生化特性反应结果

生化反应试验结果表明：D1、D2……D8菌落均能使三糖铁产酸产气、底呈黄色，确认均为同一种大肠杆菌，以下称为D菌[9]；B1、B2……B8菌落均能使三糖铁试验底部发黄，可确认是多杀性巴氏杆菌，以下称为B菌[10]。

2.3 血清型

大肠杆菌血清型试验结果表明，D菌为O26血清型大肠杆菌。

2.4 药敏试验

用16种药敏片分别对D菌和B均进行药敏试验，根据北京天坛药物生物技术开发公司纸片法药敏试验抑菌圈直径判断标准，两种菌均对恩诺沙星、单诺沙星和头孢氨苄西林高敏，对其余药物中敏或低敏。

2.5 动物试验

大肠杆菌组有1只小白鼠120h死亡，巴氏杆菌组实验动物24～48h全部死亡，混合组实验动物24h全部死亡，对照组动物没有死亡。剖检病死动物采取脏器进行细菌分离，获得与原分离菌株一致的小杆菌。

3 讨论

根据流行病学调查，观察病症，剖检、观察病理变化，采集病料进行实验室诊断，确诊为鸡多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌混合感染。动物致病试验说明，多杀性巴氏杆菌对鸡和小白鼠有较强的致病性，大肠杆菌对鸡和小白鼠的致病性稍低，若大肠杆菌和多杀性巴氏杆菌两菌同时感染鸡和小白鼠，其致病性最强，病程最短，死亡最快。

本病的综合防治主要是药物治疗和疫苗预防，用于治疗大肠杆菌病和巴氏菌病的药物较多，但由于这两种菌的致病性菌株多，对药物敏感不一致，经常使用一种药物会产生耐药性。本研究药敏试验结果可见，针对病菌的敏感药物较少，应首选高敏药物进行治疗，为避免同一药物连续使用，采取“轮换”或“交替”用药方案，同时用药剂量要充足，以减少抗药菌株的产生。目前这两种禽病疫苗免疫效果都不够理想，由于血清型较多，菌苗使用有一定的局限性。最好是从本区域病死鸡上分离出菌株，制成疫苗用于当地的预防，免疫效果则良好[9]。

本病的发生经常是由于一些不良外界因素造成，做好平时的饲养管理工作，使家禽保持较强的抵抗力是预防本病的最关键措施。为了预防本病的发生，建议该鸡 场以后应加强饲养管理，搞好清洁卫生，发现病禽及时隔离，将禽舍和设备清洗干净，并彻底消毒[10]，进而避免或杜绝引起发病的诱因，大大减少发病或不发病。此外，每年定期进行预防接种。

[1]卡尼尔克BW,禽病学(第10版)[M].北京: 中国农业出版社, 1999.

[2]陈一兵, 刘建凤, 印继华等.鹅感染多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌的分离鉴定[J].动物科学与动物医学, 2004(8): 54-56.

[3]杨本升, 刘玉斌, 苟仕金等.动物微生物学[M].长春: 吉林科技出版杜, 1995.995: 597-605.

[4]Saxena,M.K.,etal.,Ribotyping of Indian isolates of Pasteurella multocida based on 16S and 23S rRNA genes[J].Veterinary research communications, 2005.29(6): 527-535.

[5]唐先春, 吴斌, 陈焕春.猪多杀性巴氏杆菌PCR检测方法的建立及其应用[J].中国兽医科技, 2004(2): 46-48.

[6]薛俊龙, 张李俊, 王采先等.山西省鸡致病性大肠杆菌的分离及生物特性分析[J].中国兽医杂志, 2008(1): 45-47.

[7]赵永旭.禽大肠杆菌病的防治[J].畜禽业, 2012(8): 70-72.

[8]吉本斯NE.伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)[M].北京: 科学出版社, 1984.

[9]乔红伟, 李舵, 肖开提.蛋鸡大肠杆菌与多杀性巴氏杆菌混合感染的诊断[J].中国家禽, 2008(10): 44-45.

[10]蔡宝祥.家畜传染病学[M].北京: 农业出版杜, 2001.