褪黑激素对香港细首纽虫(Cephalothrix hongkongiensis)性腺发育的影响及羟基吲哚-O-甲基转移酶(HIOMT)的测定*

李应东 孙世春

(中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所 青岛 266003)

褪黑激素(melatonin)是在生物进化过程中非常保守的一类激素, 广泛存在于藻类、无脊椎动物和脊椎动物体内(Vivien-Roelset al, 1984; Hardelandet al,1996; 李经才等, 2000)。自1958年首次在牛的松果体中发现以来(Lerneret al, 1958), 它的分泌、合成以及生理功能一直是学者们研究的热点。

在水生无脊椎动物中, 前人的工作先后在甲壳动物、软体动物、扁形动物、腔肠动物和纽形动物等检测到褪黑激素的存在(Vivien-Roelset al, 1986; Moritaet al, 1987; Anctilet al, 1991; Arnoultet al, 1994)。褪黑激素被认为是调节水生无脊椎动物生长、发育和繁殖的关键激素(Vivien-Roelset al, 1993; Mechawaret al,1997)。其主要作用包括清除自由基、调节生理节律和免疫等(Hardelandet al, 2003; Galanoet al, 2011)。

纽形动物褪黑激素的相关研究开始较晚, 仅有的少量工作都是由Arnoult等围绕Ramphogordius lacteus开展的。研究发现,R. lacteus体内的褪黑激素含量会随着繁殖周期和昼夜节律而改变, 其浓度在性腺成熟期低于休止期, 在白天低于夜间(Arnoultet al,1994); 外源的褪黑激素会影响R. lacteus性腺发育以及组织再生速度(Arnoultet al, 1995, 1996); 褪黑激素的主要合成酶之一羟基吲哚-O-甲基转移酶(HIOMT)位于R. lacteus脑神经节内(Arnoultet al, 2001)。

本文通过测定香港细首纽虫(Cephalothrix hongkongiensisSundberget al.)的性腺(精巢, 卵巢)和卵母细胞大小的变化, 研究了手术(去头)和褪黑激素对其性腺发育的影响, 并通过Western bolt和免疫组织化学方法对香港细首纽虫头部的HIOMT进行了测定和定位。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验所用的香港细首纽虫均采自青岛太平角潮间带石下或粗砂中, 在实验室暂养两周后开始实验。暂养期间每4—5天投喂淡水寡毛类1次, 投喂5h后换全量水, 海水盐度31, 温度20°C。实验开始前5天停止投喂。去头实验(1.2)和褪黑激素毒性实验(1.3)所用纽虫采于2012年9月上旬, 体重为(16.7±3.4)mg(11.4—19.7mg)。褪黑激素对性腺发育影响实验(1.3)及HIOMT测定和定位实验(1.4和1.5)所用纽虫采于2012年10月上旬, 体重为(15.8±4.1)mg (10.8—17.9mg)。

1.2 去头对性腺发育的影响

处理组纽虫用7.5%的MgCl2麻醉后, 将纽虫头部(口前)切除。对照组使用正常纽虫。实验容器为15cm培养皿, 每个培养皿随机放入5条纽虫, 设置12个平行。用恒温光照培养箱控制实验条件(温度20°C, 盐度31, 光照周期12D : 12L)。实验开始前随机抽取20条虫体固定, 实验开始20天后第1次取样,之后每隔5天取样1次, 每次每个培养皿取1条纽虫固定, 备做组织学研究。实验过程中, 每隔5天换水1次, 不投饵。

用于石蜡切片的纽虫用7.5% MgCl2麻醉后于身体中后部取5—10mm长的片段, Bouin’s液固定。梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 石蜡包埋、切片(厚度8μm)。常规H.E染色。Nikon Eclipse E600显微镜观察,Olympus DP72数码成像系统拍照, CellSens stardard软件测量性腺/卵子的长径(a)和短径(b)。并用下列公式估算标准化直径: 标准化直径每个样品测量6组数据, 取最大值用于后续数据分析(即以最大数据表示样品的性腺发育水平)。

1.3 褪黑激素对成活率及性腺发育的影响

参照其他学者对涡虫(Yoshizawaet al, 1991)和纽虫(Arnoultet al, 1996)的研究, 选取6个浓度的褪黑激素(25, 50, 75, 100, 150和200mg/L)及1个空白(0mg/L)对照, 首先对香港细首纽虫进行毒性实验, 旨在找到其耐受浓度。用恒温光照培养箱控制实验条件(温度20°C, 盐度31, 光照周期12D : 12L)。实验容器为15cm培养皿, 每个培养皿放入褪黑激素海水溶液100mL。每个浓度3个平行, 每个平行10条纽虫。实验共进行60天, 实验过程中不投饵, 每5天全量更换试液。

参考毒性试验的结果, 选取3个浓度(25, 50和75 mg/L)的褪黑激素及1个对照(0mg/L)对去除头部的香港细首纽虫进行试验, 检测外源褪黑激素对性腺发育的影响。每个浓度6个平行。实验容器同上, 每个培养皿放试液100mL, 10条纽虫。实验过程中不投饵, 每5天全量更换试液。实验开始前对实验纽虫随机抽取20条固定, 实验开始后第1次取样在培养20天后, 之后每隔10天取样1次, 每次每个培养皿随机抽取2条纽虫固定, 进行组织学研究。组织学研究方法同1.2。

1.4 羟基吲哚-O-甲基转移酶(HIOMT)的Western blot测定

取10条纽虫, 迅速割取头部(口前部分), 0.01mol/L的PBST洗3次, 每次5min。之后冰盒上匀浆, 4°C离心。取100μL上清液沸水浴10min, 加入上样缓冲液进行12% SDS-PAGE电泳。蛋白质转膜。BSA 4°C孵育膜过夜。一抗使用BSA稀释500倍的兔抗小鼠ASMTY/HIOMT(Abcam公司), 4°C孵育过夜。PBST洗3次, 每次5min。二抗使用PBST稀释2000倍的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG, 37°C孵育2h。PBST洗3次, 每次5min, DAB显色。

1.5 羟基吲哚-O-甲基转移酶(HIOMT)的免疫组织化学定位

选取活跃的纽虫, MgCl2麻醉后割取头部(口前部分), 4%多聚甲醛固定。梯度酒精脱水, 二甲苯透明,石蜡包埋、切片(厚度5μm), 甘油蛋白粘片。经二甲苯脱蜡、梯度酒精复水后, 0.01mol/L的PBST洗3次,每次5min。3% H2O2-PBS孵育10min。PBST洗3次,每次5min, 10%山羊血清室温封闭2h。一抗使用10%山羊血清稀释400倍的兔抗小鼠ASMTY/HIOMT(Abcam公司), 4°C孵育24h后再室温孵育1h。PBST洗3次, 每次5min。二抗使用PBST稀释2000倍的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG, 37°C孵育2h。PBST洗3次, 每次5min, DAB显色。

1.6 数据分析

数据使用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan多重比较。显著性水平用P<0.05表示。

2 实验结果

2.1 手术(去头)对性腺发育的影响

见图1。在实验开始时, 性腺均未发育。培养20天后, 去头个体性腺已经发育, 精巢、卵巢和卵母细胞的平均直径分别为(85.0±43.8) μm、(121.4±25.7) μm和(57.4±9.5) μm; 30天时, 精巢、卵巢的大小及配子成熟度均高于20天, 卵母细胞的平均直径在80μm左右;40天时, 卵细胞成熟, 平均直径接近100μm, 并且精巢中有大量成熟精子。对照组个体在整个实验过程中未见性腺发育。

图1 去除头部对香港细首纽虫性腺发育的影响——精巢、卵巢和卵母细胞的标准化直径(平均值±标准差; n=12)Fig.1 The effect of decapitation on gonad development of C.hongkongiensis. Data are presented as standardized diameters of testes, ovaries, and oocytes (mean±SD; n=12)

2.2 褪黑激素对成活率和性腺发育的影响

不同浓度的褪黑激素对香港细首纽虫成活率的影响见图2。结果表明, 随着褪黑激素浓度的上升, 纽虫出现活性变差、不摄食、断尾、吐吻、对外界刺激无反应和死亡率高等现象。浓度大于75mg/L的褪黑激素对香港细首纽虫有较高的致死率。在浓度为200、150和100mg/L条件下, 香港细首纽虫分别在15天、20天和25天内全部死亡。在75mg/L浓度下, 60天内全部死亡; 50mg/L条件下60天后存活率约为70%。25mg/L浓度对纽虫的成活率无影响。实验期间, 对照组纽虫的存活率为100%, 也未见异常行为。

褪黑激素对香港细首纽虫性腺发育具有显著的抑制作用(图3)(P<0.05), 并且随褪黑激素浓度的增加,抑制作用增强。在实验开始时, 性腺未发育。培养20天后, 受试纽虫性腺均已发育, 但褪黑激素组纽虫的性腺和卵母细胞大小均显著小于对照组(P<0.05)。第30、40天时, 各个处理组的性腺(精巢、卵巢)和卵母细胞的大小均表现为75mg/L组<50mg/L组<25mg/L组<0mg/L组。其中, 第40天时, 75mg/L组的性腺已退化消失。

图2 不同浓度褪黑激素对香港细首纽虫成活率的影响(平均值±标准差; n=3)Fig.2 Survival rate of C. hongkongiensis under melatonin solutions of different concentrations (mean±SD; n=3)

图3 不同浓度褪黑激素对香港细首纽虫性腺发育的影响——精巢、卵巢及卵母细胞的标准化直径(平均值±标准差; n=12)Fig.3 Impact of melatonin on gonad development of C.hongkongiensis. Data are presented as standardized diameters of testes, ovaries, and oocytes (mean±SD; n=12)

2.3 HIOMT的测定和定位

香港细首纽虫头部蛋白与兔抗小鼠HIOMT抗体Western blot免疫印迹实验显示, 在约38kDa处有明显的阳性条带(图4)。说明香港细首纽虫的头部存在HIOMT。由图5可以看出, HIOMT亲和免疫定位发生在脑神经节内侧的几个神经细胞中, 呈对称分布。对照组无阳性反应。

图4 香港细首纽虫头部HIOMT的Western blot检测Fig.4 Western blot for HIOMT of the cephalic region of C.hongkongiensis

图5 香港细首纽虫脑部HIOMT的免疫组织化学定位Fig.5 Immunocytochemistry of HIOMT in the cerebral ganglia of C. hongkongiensis

3 讨论

大多数水生无脊椎动物会通过神经系统来对生长、发育和繁殖进行调节(Golding, 1974; Hartenstein,2006)。去除其主要的神经激素中心, 会使生长和繁殖受到影响。如切除甲壳动物的眼柄, 会使其性腺发育速度加快(Primavera, 1978); 去除涡虫的头部会使其断裂再生速度加快(Moritaet al, 1984)。对纽虫的研究也发现, 手术去除Ramphogordius lacteus的脑部会使其性腺发育速度加快(Gontcharoffet al, 1958)。Vernet等(1988)认为纽虫脑神经中枢分泌的性腺发育抑制激素(GIH)是控制其性腺发育的主要激素, 去除这种激素会使纽虫的性腺迅速发育。去头术可迅速诱导香港细首纽虫的性腺发育, 表明香港细首纽虫的头部也存在GIH或类似物抑制其性腺发育。一些学者们推测, 纽虫GIH分泌可能受褪黑激素的直接或间接调节(Vernetet al, 1993; Arnoultet al, 1994,2001)。

自Vivien-Roels等(1984)在昆虫的复眼中发现褪黑激素以来, 已在多种无脊椎动物体内检测到褪黑激素(Vivien-Roelset al, 1993; Roopinet al, 2012)。在对纽形动物的研究中, Arnoult等(2001)应用放射免疫法在异纽目纽虫R. lacteus的脑和眼点中检测到褪黑激素的存在, 且其含量存在昼夜变化, 说明该激素的合成可能受光的调控(Arnoultet al, 1994)。本文通过Western blot方法在香港细首纽虫的头部组织检测到了褪黑激素合成酶HIOMT[褪黑激素合成的一种特异性标记(Arnoultet al, 2001)] (图4), 免疫组化结果显示其分布于脑神经节的少数几个细胞(图5), 说明香港细首纽虫的中枢神经也具有合成褪黑激素的功能。Arnoult等(2001)认为纽虫脑神经节中的这些细胞可能与脊椎动物松果体、视网膜中的光受体细胞类似。

虽然很多研究指出褪黑激素具有抗衰老、延长寿命的功能(Bakaevet al, 1997), 但外源褪黑激素对无脊椎动物的作用因浓度和物种而不同。过高的环境褪黑激素浓度可能具有毒性效应, 如: 当褪黑激素浓度超过100mg/L时, 线虫Caenorhabditis elegans的寿命变短(Bakaevet al, 1997); 超过10mg/L时草履虫Paramecium tertaurelia的寿命变短(Thomaset al,1997); 当褪黑激素浓度达到50mg/L时, 已研究的两种纽虫R. lacteus(Arnoultet al, 2001)和香港细首纽虫(图2)均出现死亡率上升、寿命变短现象。一些学者认为, 褪黑激素的抗衰老效果可能与其在细胞内清除自由基的能力有关(Anisimov, 2003)。然而, 在高浓度条件下, 褪黑激素可能成为助氧化剂(prooxidant), 进而影响动物的寿命(Anisimov, 2003; 张军等, 2008)。

外源褪黑激素不但会影响纽虫的寿命, 还会参与调节其它生理过程的节律, 如再生和繁殖(Arnoultet al, 1995, 1996)。对R. lacteus的研究显示, 其体内褪黑激素含量在繁殖期显著低于静止期, 外源褪黑激素可延迟性成熟(Arnoultet al, 1994)。本文实验中,外源褪黑激素没有阻断去头对香港细首纽虫性腺发育的诱导作用, 但明显抑制了其性腺发育速度, 且长期暴露还导致了已发育的性腺退化(图3)。这与Arnoult等(1996)的研究结果相似, 他们认为, 褪黑激素对性腺发育的抑制作用是间接的, 即通过影响GIH的分泌而影响性腺发育。

李经才, 王 芳, 霍 艳等, 2000. 从生物进化看褪黑素的功能意义. 生命科学, 12: 130—133

张 军, 胡大海, 2008. 褪黑激素抗氧化作用的研究进展. 国际药学研究杂志, 35: 189—192

Anctil M, Pani A K, Ali M A, 1991. Modulation of rhythmic contractions by melatonin via cyclic GMP in the coelenterateRenilla koellikeri. Journal of Comparative Physiology B, 161: 569—575

Anisimov V N, 2003. Effects of exogenous melatonin——a review. Toxicologic Pathology, 31: 589—603

Arnoult F, Vernet G, 1995. Inhibition of regeneration by melatonin in nemertean worms of the genusLineus.Comparative Biochemistry and Physiology Part A:Physiology, 110: 319—328

Arnoult F, Vernet G, 1996. Influence of melatonin on gonad maturation inLineus lacteus(Heteronemertini, Lineidae).Journal of Experimental Zoology, 274: 138—143

Arnoult F, Vernet G, 2001. Immunocytochemical localization of hydroxyindole-o-methyltransferase (HIOMT) in the brain ofMyoisophagos lacteus(Nemertea: Heteronemertea:Lineidae). Journal of Experimental Zoology, 290: 156—162

Arnoult F, Vivien-Roels B, Pévet Pet al, 1994. Melatonin in the nemertine wormLineus lacteus: identification and daily variations. Neurosignals, 3: 296—301

Bakaev V V, Efremov A V, Anisimov V N, 1997. An attempt to slow aging inC. elegans. 8. Melatonin reduces life span ofC.elegans. Worm Breeder's Gazette, 15: 36

Galano A, Tan D X, Reiter R J, 2011. Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination.Journal of Pineal Research, 51: 1—16

Golding D W, 1974. A survey of neuroendocrine phenomena in non-arthropod invertebrates. Biological Reviews, 49: 161—224

Gontcharoff M, Lechenault H, 1958. Sur le déterminisme de la ponte chezLineus lacteus. Comptes rendus hebdomadaires des séances de l'Académie des Sciences, 246: 1630—1632

Hardeland R, Fuhrberg B, 1996. Ubiquitous melatonin-presence and effects in unicells, plants and animals. Trends in Comparative Biochemistry and Physiology, 2: 25—45

Hardeland R, Poeggeler B, 2003. Non-vertebrate melatonin.Journal of Pineal Research, 34: 233—241

Hartenstein V, 2006. The neuroendocrine system of invertebrates:a developmental and evolutionary perspective. Journal of Endocrinology, 190: 555—570

Lerner A B, Case J D, Takahashi Yet al, 1958. Isolation of melatonin, the pineal gland factor that lightens melanocytes.Journal of the American Chemical Society, 80: 2587—2587

Mechawar N, Anctil M, 1997. Melatonin in a primitive metazoan:seasonal changes of levels and immunohistochemical visualization in neurons. The Journal of Comparative Neurology, 387: 243—254

Morita M, Best J B, 1984. Effects of photoperiods and melatonin on planarian asexual reproduction. Journal of Experimental Zoology, 231: 273—282

Morita M, Hall F, Best J Bet al, 1987. Photoperiodic modulation of cephalic melatonin in planarians. Journal of Experimental Zoology, 241: 383—388

Primavera J H, 1978. Induced maturation and spawning in five-month-oldPenaeus monodonFabricius by eyestalk ablation. Aquaculture, 13: 355—359

Roopin M, Levy O, 2012. Temporal and histological evaluation of melatonin patterns in a ‘basal’ metazoan. Journal of Pineal Research, 53: 259—269

Thomas J N, Smith-Sonneborn J, 1997. Supplemental melatonin increases clonal lifespan in the protozoanParamecium tetraurelia. Journal of Pineal Research, 23: 123—130

Vernet G, Bierne J, 1988. Neuroendocrine control of gonadogenesis in regeneratingLineus lacteus(Heteronemertea).Hydrobiologia, 156: 53—60

Vernet G, Bierne J, 1993. The influence of light and sea water temperature on the reproductive cycle ofLineus ruber(Heteronemertea). Hydrobiologia, 266: 267—271

Vivien-Roels B, Pévet P, 1986. Is melatonin an evolutionary conservative molecule involved in the transduction of photoperiodic information in all living organisms. Journal of Pineal Research, 1: 61—68

Vivien-Roels B, Pévet P, 1993. Melatonin: presence and formation in invertebrates. Experientia, 49: 642—647

Vivien-Roels B, Pevet P, Beck Oet al, 1984. Identification of melatonin in the compound eyes of an insect, the locust(Locusta migratoria), by radioimmunoassay and gas chromatography-mass spectrometry. Neuroscience Letters,49: 153—157

Yoshizawa Y, Wakabayashi K, Shinozawa T, 1991. Inhibition of planarian regeneration by melatonin. Hydrobiologia, 227: 31—40