微小RNA-122对丙型肝炎病毒复制及感染治疗影响的研究进展

江志奎

上海市徐汇区大华医院，上海 200237

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是带包膜的单正链RNA 病毒，属于黄病毒科。其9.6 kb的基因组可直接作为mRNA翻译成一个大分子蛋白前体，再由宿主及病毒自身的蛋白酶剪切成10个病毒蛋白，包括结构蛋白和非结构蛋白[1,2]。HCV是RNA病毒，不能整合入宿主基因组；但其编码的非结构蛋白可与宿主直接相互作用而影响细胞的周期、凋亡、转录、膜结构调节、免疫反应等，最终引起细胞恶性转化[3,4]。HCV感染极易演变为慢性肝炎，慢性感染者20%可进展为肝纤维化、肝硬化，2.5%最终可发展为肝癌[5,6]。然而，至今尚无预防HCV感染的有效疫苗。现有的以干扰素/利巴韦林为主的抗病毒治疗应答率较低，仅部分HCV感染者能产生持续免疫应答[7,8]，且药物不良反应多、费用昂贵，因此需进一步研究能直接抗病毒且无毒副作用的联合疗法。

微小RNA(microRNA， miRNA)是一类约22个碱基的小分子非编码RNA，主要与靶基因mRNA 3′非编码区部分互补，促进靶基因mRNA降解或抑制其翻译过程而发挥负调控作用[9]。miRNA来源于细胞核RNA聚合酶Ⅱ转录的初级产物(primary microRNA, pri-miRNA)，在Drosha的作用下被切割成60～90个碱基的发夹状前体(precursor microRNA, pre-miRNA)。出核后的pre-miRNA再经Dicer剪切，产生20～22个碱基大小的成熟miRNA。miRNA结合到RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)，直接降解靶mRNA或抑制靶mRNA翻译[10]。每个miRNA可通过不同靶基因广泛参与细胞转录，从而达到细胞生理学平衡。近期研究表明，这种功能及miRNA表达谱的改变在宿主应对病毒感染中也发挥重要作用[11]。不仅如此，病毒本身也可编码miRNA，从而调节宿主细胞功能以适应病毒感染[12-14]。本综述重点介绍miRNA-122(miR-122)与HCV相互作用的研究现状。

1 miR-122的概况

miR-122是含有22个碱基的肝脏特异性miRNA[15]，从鱼类至哺乳动物其序列非常保守。miR-122是肝脏中表达最丰富的miRNA，阳离子氨基酸转运体1(cationic amino acid transporter 1，CAT-1)可能是miR-122的靶蛋白[16]。miR-122的主要生理功能是调节脂质和胆固醇代谢。在正常小鼠中抑制miR-122可导致血浆胆固醇水平降低，肝脏脂肪酸氧化增加，肝脂肪酸和胆固醇的合成减少，还能增加中央代谢传感器AMP活化蛋白激酶(activated protein kinase，AMPK)的活性。在饮食诱导的肥胖小鼠模型中，抑制miR-122导致血浆中胆固醇降低和脂肪肝显著改善，且伴随着一系列脂肪合成基因减少[17]。

2 miR-122对HCV感染的影响

1999年，HCV亚基因组复制子系统的建立使HCV感染细胞的可持续培养成为可能，为详细研究HCV感染相关分子机制提供了分子生物学基础[18]。然而有趣的是，这些早期复制子系统只能在Huh7细胞中持续复制，不能在HepG2细胞中实现，虽然这2株细胞均源于人类肝癌。2005年这种差异的原因首次被Jopling等阐明，他们发现Huh7细胞表达miR-122，而HepG2细胞不表达。在Huh7细胞中抑制miR-122能降低HCV RNA聚集及病毒蛋白表达，突变分析提示miR-122与病毒5′非编码区存在结合区域。复制缺陷性病毒模型证实，miR-122并不影响mRNA的翻译和RNA的稳定性[19]。随后Jopling等证明HCV基因组非编码区域包含有miR-122种子序列的识别位点[20]。

miR-122促进Huh7中HCV复制已基本明确。Chang等通过在HEK-293细胞中外源性表达miR-122，检测miR-122对非肝细胞中HCV复制的影响，发现miR-122能增强HCV复制子集落形成的效率，提高HEK-293细胞中HCV RNA的稳态水平。由此可见，miR-122虽然不是HCV感染所必需的，但它大大提高了非肝细胞中HCV的复制[21]。随后，Fukuhara等也发现了miR-122对非肝细胞中HCV复制的重要性。在非肝细胞株表达HCV入侵受体后，人子宫来源的Hec1B细胞感染HCVcc(HCV体外培养系统)表现出较低的HCV基因组复制水平。而在一些细胞中，外源性表达miR-122有利于高效病毒复制，但不生产感染性颗粒，这可能是由于缺乏肝细胞的脂质代谢。此外，miR-122与HCV RNA之间的这种特异性相互作用是增强HCV复制必不可少的[22]。

在HCV的生命周期中，miR-122发挥功能取决于其与位于HCV茎-环1和内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)之间2个位点的直接相互作用。这2个匹配位点均为9个核苷酸，在细胞培养中能被miR-122在同一个HCV RNA拷贝中识别。这2个位点的联合突变能阻止感染性病毒产生，而单个突变只能严重减弱病毒产生[23]。miR-122靶向HCV的功能与经典miRNA的作用并不相同，miR-122与HCV的相互作用能增强HCV RNA积累，并不造成mRNA降解，且这种相互作用发生在HCV的5′非编码区。因此，HCV与miR-122的相互作用如何影响HCV复制并不完全明确，造成这种功能差异的原因及具体分子机制还需进一步研究。

以上研究均表明，miR-122在HCV复制中发挥重要作用，但其并不是HCV RNA复制所必需的。后几代复制子系统，包括其他HCV基因型来源的克隆，已被证实能在HepG2细胞[24]、人类子宫颈癌HeLa细胞[25]和小鼠肝细胞(小鼠肝癌细胞Hepal-6)[26]中成功复制。但是，上述发现均来自于体外细胞培养实验，尚没有在临床感染中被证实。例如，HCV感染者肝组织中RNA病毒载量与miR-122表达水平并没有相关性[27]。

3 靶向miR-122治疗HCV感染的新策略

miR-122作为HCV复制的一个重要辅助因子，是一个潜在的治疗慢性HCV感染的靶点。在小鼠和非人类灵长类动物中，通过反义抑制剂，包括antagomir和锁核酸(locked nucleic acid，LNA)修饰的寡核苷酸，能抑制体内miR-122水平[28]。Lanford等发现，应用与miR-122互补的LNA修饰寡核苷酸(SPC3649)治疗慢性HCV感染黑猩猩，能持久抑制HCV，且不良反应较小。无论是在为期12周的治疗期间还是在16周的随访期，均没有观察到SPC3649耐药病毒株的出现，提示受治疗动物没有产生病毒抗性。此外，转录组和肝活检组织学分析表明干扰素调节基因下调，HCV诱导的肝组织病理损伤具有明显改善[29]。进一步研究表明， LNA修饰的寡核苷酸抑制miR-122，能降低包括HCV 的7种基因型感染[30]。基于LNA的miR-122抑制剂SPC3649，目前在临床试验中也取得较好的效果[31]。

虽然miR-122与HCV相互作用的研究很多，但不是唯一的。Murakami等通过靶向HCV基因组的miRNA预测，发现miR-199a具有HCV基因组的相似序列，且这一序列在HCV各基因型中非常保守。过表达miR-199a能抑制HCV基因组在2种复制子细胞(HCV-1b和HCV-2a)中的复制。特定反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASO)介导的miR-199a抑制能加速病毒复制。HCV中突变miR-199a的目标位点能降低miR-199a对复制子的影响。miR-199a能将HCV复制子RNA聚集到RISC中，且这种抗病毒效果是干扰素通路非依赖性的[32]。miR-196也包含与HCV互补的序列，能在复制子细胞株(HCV-1b和HCV-2a)中抑制HCV复制[33]。Bandyopadhyay等发现miR-29在HCV感染过程中也发挥重要作用。在大多数HCV感染患者中，miR-29表达下调。miR-29能调节细胞外基质蛋白表达。在细胞培养系统中，HCV感染能下调miR-29表达，miR-29过表达则降低HCV RNA的丰度[34]。

值得一提的是，抑制miR-122相关的血红素氧化酶1(heme oxygenase 1，HO-1)能减少HBV复制[35]。在该研究中，Qiu等通过抑制miR-122和转染miR-122类似物，检测乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)在肝癌细胞中的表达。结果显示，过表达miR-122能抑制HBV表达，而内源性miR-122删除则导致转染细胞中HBV增加。进一步研究发现，miR-122是通过下调HO-1发挥作用的。因此，抑制miR-122表达虽能降低HCV复制，但会增加HBV复制，在合并感染患者中这是一个需考虑的重要因素。随着miR-122抑制剂在临床试验中的应用，了解miR-122影响HCV感染的分子机制及相应耐药突变的产生非常重要。这些结果提示，靶向miR-122的治疗可能会成为治疗慢性HCV感染的新策略。

4 结语

越来越多的证据表明，靶向miRNA的药物在治疗慢性HCV感染中具有一定的潜力。目前，虽然miR-122是唯一一个用于临床试验治疗慢性HCV感染的miRNA，但其他miRNA，包括miR-196、miR-199a和miR-29，均可能作为潜在的治疗靶点。基于靶向这些miRNA的联合治疗，不仅能提高抗病毒效率，还能保护患者免受HCV复制所带来的伤害。miRNA具有多个功能性靶基因及调节不同信号通路的特性，也许能使患者避免负面的治疗效果。然而，HCV与miRNA相互作用的具体分子机制还未完全阐明，尚需开展进一步的体外实验和临床验证。基于miRNA的治疗方法将为HCV感染的预防和治疗提供新的思路。

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