耻垢分枝杆菌在感染与免疫研究中的应用

侯晓青，刘丹，王易

上海中医药大学免疫学与病原生物学教研室，上海 201203

耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis，M.smegmatis)近年来较多应用于分枝杆菌感染及相关的免疫学研究中，是一种相对理想的实验模型，这主要基于其生物学特性和良好的实验安全性。此外，在围绕其免疫生物学特点而引申展开的其他有关感染与免疫研究中，也有一些新的发现。

1 耻垢分枝杆菌的主要生物学特性

耻垢分枝杆菌由Lustgarten于1884年从梅毒患者的硬下疳和梅毒瘤中分离获得。1年后，Alvarez和Tavel在健康人生殖器分泌物中也发现了与Lustgarten描述相似的微生物，耻垢分枝杆菌据此得名。耻垢分枝杆菌是一种抗酸分枝杆菌[1]。与放线菌门分枝杆菌属的其他分枝杆菌比较，耻垢分枝杆菌有以下特性。

1.1 快速生长与非致病性

耻垢分枝杆菌的生长速度是结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tuberculosis)的10倍[2]。分枝杆菌的生长速率可能取决于其核糖体的操纵子。通常分枝杆菌属具有2种核糖体RNA操纵子rrnA和rrnB[3]，rrnA为所有分枝杆菌共有，依菌种的不同可含有2～5个启动子。只有1个启动子的rrnB仅存在于生长快速的分枝杆菌中[4]，如耻垢分枝杆菌。耻垢分枝杆菌在大多数实验室合成培养基中培养3～5 d即可形成可见菌落。对于正常个体，耻垢分枝杆菌基本可视作非致病菌[5]。耻垢分枝杆菌的非致病性与其基因的稳定性相关，mutM和mutY是2个主要核苷酸修复酶(与修复DNA氧化性损伤有关)的编码基因。研究mutY缺陷耻垢分枝杆菌时发现，mutY基因具有稳定耻垢分枝杆菌非致病性的功能[6]。

1.2 基因与结构特性

耻垢分枝杆菌的基因组测序已完成，与结核分枝杆菌共享超过2 000个同源染色体，具有与结核分枝杆菌及其他分枝杆菌相同的独特细胞壁结构。这些特性使耻垢分枝杆菌成为研究结核分枝杆菌和其他致病性分枝杆菌的实验模型。通过对耻垢分枝杆菌mc2155菌株的细胞表面蛋白分析，可了解耻垢分枝杆菌生长特性；同时，对复合脂质代谢和细菌环境相互作用机制的研究，为抗分枝杆菌药物的研发提供了一条新的途径[7]。耻垢分枝杆菌具有分枝杆菌普遍存在的通道形成蛋白——孔蛋白，此结构可影响其对杀菌剂的易感性[8]。研究证实，耻垢分枝杆菌摄取硝酸盐和硫酸盐均依赖于孔蛋白[9]。耻垢分枝杆菌生物膜的形成依赖环境中多磷酸盐的含量[10]，其抗酸染色特性与酸性压力下参与类胡萝卜素生物合成的蛋白有关[11]。

1.3 免疫应答特性

耻垢分枝杆菌通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶/肿瘤坏死因子(cysteinyl aspartate specific proteinase/tumor necrosis factor，caspase/TNF)依赖途径诱导宿主细胞凋亡。相对于特殊致病分枝杆菌来说(如结核分枝杆菌)，非致病菌可诱导机体产生更强的天然免疫应答。经检测耻垢分枝杆菌感染后宿主细胞的荷菌数及白细胞介素12(interleukin 12，IL-12)和TNF的分泌水平后证实，天然免疫应答可能是非致病性快速生长分枝杆菌被杀伤的主要原因[12]。

2 耻垢分枝杆菌在抗结核分枝杆菌研究中的应用

作为研究结核分枝杆菌的替代模型，耻垢分枝杆菌较多应用于结核分枝杆菌的基因与结构分析、耐药性和疫苗研究。

2.1 耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌功能蛋白及基因研究

耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌一样，可以休眠状态适应微氧环境，但其休眠机制尚未完全明确。前期大量实验证实，低氧和低碳这2个压力因素可诱导宿主体内结核分枝杆菌休眠。在此基础上，Cordone等[13]对参与休眠活动的基因进行了鉴定并描述了这些基因的特征。该实验分别研究了不能在低氧和低碳环境中存活的2种耻垢分枝杆菌突变株，发现均为uvrA基因发生突变，只是转座子插入区域不同，但并不影响其表型。插入结核分枝杆菌uvrA基因后，耻垢分枝杆菌uvrA突变株的功能得到修复，证实uvrA缺失使其不能在低氧和低碳环境中存活；同时表明结核分枝杆菌与耻垢分枝杆菌的uvrA基因具有一定同源性。

rv0901是结核分枝杆菌的一种蛋白编码基因，其功能尚不明确。为探索其特征，Zhang等[14]从结核分枝杆菌标准毒株H37Rv的基因组中扩增该基因，进行蛋白表达并纯化。通过构建含rv0901的重组质粒，并将其电转化至耻垢分枝杆菌中，诱导受体菌表达目的蛋白Rv0901，经十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)电泳鉴定该蛋白；通过测定细胞或动物的存活率、凋亡率、一氧化氮(nitric oxide, NO)和干扰素γ(interferon γ，IFN-γ)分泌量，研究重组耻垢分枝杆菌基因或蛋白功能。结果证实，rv0901与结核分枝杆菌的毒力和免疫原性有关。

结核分枝杆菌编码基因rv3402c在被感染的人和小鼠巨噬细胞中均上调。实验构建表达rv3402c基因的耻垢分枝杆菌，证实其编码蛋白能增加胞内重组菌存活，存活率的提高与其对TNF-α、IL-1β等前炎症因子所致损害的抵抗性相关，也与形成前炎症因子的相关信号转导通路——核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)、p38等相关[15]。

2.2 耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌耐药性研究

张文利等[16]将耻垢分枝杆菌用于研究影响结核分枝杆菌的生存因素，以及研发抗结核化合物、治疗耐药结核分枝杆菌感染。结果发现，分枝杆菌的生存和繁殖依赖其细胞壁结构的完整和准确，其细胞壁的特殊结构成分具有聚阿拉伯糖。细胞壁结构及其合成因素，可直接影响细胞壁结构的完整性。在分枝杆菌中，Emb蛋白家族(EmbA、EmbB、EmbC)参与聚阿拉伯糖的生物合成。构建EmbB的N端跨膜区与EmbC的C端结构域相结合的杂化质粒表达载体 pVV16-BN722-CC36，同时构建表达载体pVV16-BN722，它们能在耻垢分枝杆菌中表达，经测序鉴定表达正确后分别转入相应的耻垢分枝杆菌(embC基因敲除菌株△embC、embB基因敲除菌株△embB和野生型耻垢分枝杆菌)以研究基因的功能。用蛋白免疫印迹法测定相关蛋白，发现EmbC蛋白的C端结构域具有催化功能，但在发挥作用时需N端结构域使其能定位在某一特定位置，否则不能正确催化脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)中聚阿拉伯糖的合成。关于EmbB蛋白，其N端完整的跨膜区除能使EmbB蛋白定位于特定位置外，还具有一定的催化活性。该研究表明，对于Emb家族成员，能在细胞膜上正确定位是其发挥作用的前提；同时，虽然Emb家族成员间的同源性非常高，但定位作用不能相互补充与替代。

多重耐药和广泛耐药结核病的传播是棘手的公共健康问题。已发现苯并噻嗪酮(benzothiazinone，BTZ)和二硝基苯甲酰胺(dinitrobenzamide，DNB)具有较高的抗结核分枝杆菌(包括广泛耐药菌株)的活性。BTZ的靶点是DprE1蛋白，已有研究证实DNB与BTZ可依赖相同通路抑制耐药菌株生长，表明DNB可能与BTZ有同样的作用靶点。在耻垢分枝杆菌中，硝基还原酶NfnB过表达可使硝基向氨基转化大量减少，导致BTZ失活。分离天然耐DNB的耻垢分枝杆菌突变株，其中16株DprE1的Cys394发生突变的菌株对DNB高度抵抗，荧光滴定和质谱分析表明这跟DprE1与DNB连接有关。对DNB抵抗水平低的耻垢分枝杆菌突变株含有多种编码NfnB反转录抑制剂的突变。液相色谱/质谱/质谱联用法分析表明，NfnB也是DNB失活的原因。以上研究表明，耻垢分枝杆菌中DNB与BTZ药物具有共同抗菌机制[17]。

2.3 耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌噬菌体研究

噬菌体能侵入并裂解宿主细胞，在胞内菌所致感染性疾病中具有很好的应用价值。抗生素广泛应用后其应用价值被忽视，而耐药菌株的出现使人们再次对其进行评价。刘平等[18]利用耻垢分枝杆菌对用分枝杆菌噬菌体Legendre治疗耐药结核病的潜力进行了研究，通过制备Legendre噬菌斑，纯化噬菌体后得知其属长尾噬菌体科；提取其基因组，确定核酸类型为双链DNA噬菌体；Legendre抗原性低，宿主谱广，对耻垢分枝杆菌极度易感，能裂解耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌标准株及多数临床耐药株，具有抗耐药结核病的潜力。然而，在噬菌体的实际应用中，还存在许多未知因素。如Chen等[19]研究证实，糖肽脂生物合成的缺乏导致了耻垢分枝杆菌对噬菌体I3的抵抗，这可能是结核分枝杆菌逃脱噬菌体杀灭的机制。

2.4 耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌疫苗研究

目前可应用的结核分枝杆菌疫苗只有卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)，且不能取得满意的保护率，故寻求效率更高的疫苗以降低结核病的全球传播成为迫切需求。在新型结核分枝杆菌疫苗研究中，使用带有结核分枝杆菌保护性表位的重组耻垢分枝杆菌成为经典方法。

肝素结合血凝素(heparin-binding haemagglutinin，HBHA)是分枝杆菌细胞表面介导细菌黏附于上皮细胞的蛋白，与结核分枝杆菌的播散有关，故被认为是一种可激活细胞免疫的候选免疫原。但研究发现，只有甲基化的HBHA才能有效激发淋巴细胞分泌大量IFN-γ，发挥类似BCG的保护性免疫作用。有研究构建了HBHA与人IL-2(human IL-2，hIL-2)融合的重组耻垢分枝杆菌，发现其产生的HBHA可表现为具有免疫原性的甲基化形式。该重组菌株在小鼠体内可诱导保护性免疫应答，促进IFN-γ和IL-2分泌，且减少肺内荷菌量，效果类似于BCG[20]。

esx-3是分枝杆菌进化中的一个保守基因，参与分枝杆菌对天然免疫杀灭的逃逸。带有完整esx-3基因的耻垢分枝杆菌经静脉大剂量接种，可使小鼠迅速致病；而esx-3缺陷株感染的小鼠，则可经髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)依赖的免疫应答清除细菌。向该突变株中引入结核分枝杆菌esx-3基因后，小鼠具有一定的免疫力，虽较esx-3缺陷株明显减弱，但仍可对强毒性结核分枝杆菌产生杀伤作用。该研究表明，重组菌株产生较多的保护性免疫依赖的记忆性CD4+T细胞，还有适应性免疫应答细胞因子参与。该研究揭示了esx-3基因的毒力作用，表明esx-3缺陷重组株是潜在的有效的结核分枝杆菌备选疫苗[21]。

6 kDa早期分泌性抗原靶分子(early secretory antigenic target of 6 kDa，ESAT-6)是从结核分枝杆菌培养滤液中分离得到的一种早期分泌蛋白。esat-6基因仅存在于结核分枝杆菌等致病性分枝杆菌中。ESAT-6蛋白可诱导T细胞增殖活化和细胞因子分泌，与结核分枝杆菌免疫原性相关，提示其可成为结核分枝杆菌疫苗的候选基因。李岩等[22]用穿梭载体将结核分枝杆菌esat-6基因转入耻垢分枝杆菌，确定其能在耻垢分枝杆菌中表达，且导入后不影响耻垢分枝杆菌的生长，也不增加重组菌对巨噬细胞的毒性。诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是在某些刺激物(如细菌脂多糖、TNF和IFN-γ等)诱导下才表达的巨噬细胞的一种活化标记。通过检测巨噬细胞iNOS表达水平、裂解巨噬细胞计数胞内存活细菌数，证实重组菌能诱导巨噬细胞活化表达iNOS，并增强巨噬细胞的杀伤活性，且重组菌在胞内存活数显著低于对照组。

徐苗等[23]对耻垢分枝杆菌疫苗抗结核分枝杆菌感染的作用机制进行了研究，发现活化巨噬细胞中产生的NO在抗微生物感染中具有重要作用，可有效抑制或杀灭结核分枝杆菌，且NO生成量与其抑制能力呈正相关。该研究选用耻垢分枝杆菌疫苗对免疫动物NO产生水平的影响来探讨其抗结核分枝杆菌感染的机制，结果显示，不同剂量疫苗免疫小鼠产生的NO水平均显著高于对照组，提示该疫苗可促进小鼠巨噬细胞产生NO，并对免疫功能进行调节。

2.5 耻垢分枝杆菌与结核病治疗及其机制研究

自噬是包括分枝杆菌在内的病原菌入侵细胞后引起的胞内应答，能被哺乳动物西多莫司(雷帕霉素)靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的直接抑制剂诱导，然后杀灭感染细胞中的分枝杆菌。但Zullo等[24]研究显示，分枝杆菌感染的巨噬细胞在诱导自噬的同时也激活mTOR；选用耻垢分枝杆菌再次实验后发现，低浓度mTOR抑制剂可有效减少或阻断mTOR活性，以应对分枝杆菌感染，杀灭耻垢分枝杆菌所需抑制剂浓度更高。而在自噬相关基因和蛋白缺陷来源的巨噬细胞中，高浓度抑制剂也可抑制耻垢分枝杆菌生长，提示高浓度下非自噬机制可能参与了杀菌过程，进一步表明由mTOR抑制剂诱导的自噬是一种人为增强杀灭分枝杆菌的方法，但还有更多自噬相关的内源性生化过程有待揭示。

3 耻垢分枝杆菌在非结核分枝杆菌感染与免疫研究中的应用

除作为研究结核分枝杆菌感染的模型外，耻垢分枝杆菌也用于其他抗感染研究和超敏反应性疾病研究。

3.1 重组耻垢分枝杆菌与幽门螺杆菌定植及抗幽门螺杆菌研究

2009年，徐永柱等构建了携带幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)ureB基因质粒(pLUB)的重组耻垢分枝杆菌疫苗，用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)标记该重组菌，构建感染模型。结果显示，小鼠胃、脾中均检测到GFP表达，其他组织及对照组未检测到绿色荧光；其他指标与对照组无差异。由此确定重组耻垢分枝杆菌可在胃和脾组织中分布，且对小鼠无系统毒性作用[25]。幽门螺杆菌感染是一种黏膜感染，黏膜免疫可对感染小鼠产生保护作用。Lü等[26]构建表达幽门螺杆菌外膜蛋白26(outer membrane protein 26 kDa，Omp26)抗原的重组耻垢分枝杆菌黏膜免疫疫苗，与野生耻垢分枝杆菌株对照，重组疫苗免疫的小鼠60%未感染幽门螺杆菌；与对照组相比，慢性胃炎的组织病理改变也较轻微；反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)结果提示，重组耻垢分枝杆菌免疫后胃和脾中IL-2和IFN-γ表达增加。结果表明，该重组疫苗具有抗幽门螺杆菌感染的预防性保护作用，也表明抗原诱导的免疫应答可抑制幽门螺杆菌定植。

机体自然感染幽门螺杆菌后产生的免疫应答不能清除细菌，持续感染反导致胃黏膜免疫病理损害。有效的疫苗/制剂接种可诱导机体产生保护性免疫应答，但机制尚不明确。向廷秀等[27]用耻垢分枝杆菌初步探讨预防幽门螺杆菌感染的作用机制，在用重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠后进行幽门螺杆菌攻击。结果显示，免疫后重组耻垢分枝杆菌制剂可诱导幽门螺杆菌特异性IgG、IgA水平升高，以IgG2a占优势。用幽门螺杆菌抗原刺激后，各免疫组小鼠脾淋巴细胞均明显增殖，胃黏膜固有层IgA阳性标记腺体数明显高于对照组。幽门螺杆菌攻击前，各免疫组胃和脾组织中已出现Th1型细胞因子IFN-γ、IL-12、IL-2表达，而无Th2型细胞因子IL-4、IL-6、IL-10表达，对照组和野生耻垢分枝杆菌组胃黏膜和脾组织中各细胞因子均无表达。幽门螺杆菌攻击后，对照组和野生耻垢分枝杆菌组胃组织中出现以IFN-γ为主的细胞因子增多，且显著高于重组耻垢分枝杆菌组；而重组耻垢分枝杆菌制剂组脾组织中则出现以IL-4为主的细胞因子增多，且显著高于对照组。结果提示，含有幽门螺杆菌抗原的重组耻垢分枝杆菌通过调节Th1/Th2平衡而产生作用。

3.2 耻垢分枝杆菌与哮喘黏膜免疫干预研究

郭盛等[28]用卵清蛋白(ovalbumin peptide，OVA)致敏气道激发建立哮喘模型，实验设哮喘组、耻垢分枝杆菌干预组和对照组。结果显示，耻垢分枝杆菌干预可显著增高哮喘小鼠肺组织防御素β2(defensin β2，Ddfb2)mRNA表达，降低哮喘小鼠表达增高的巨噬细胞炎性蛋白1(macrophage inflammatory protein 1，MIP-1)mRNA；降低支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)和淋巴结培养上清液中的MIP-1、MIP-2、IL-4，增加BALF中的IFN-γ；显著降低血清总IgE、OVA-IgE、OVA-IgG1，增加OVA-IgG2a，降低OVA特异性IgG1/IgG2a比值。综上结果表明，耻垢分枝杆菌黏膜免疫可干预哮喘发生，使耻垢分枝杆菌有望成为继BCG之后通过调节IgG1/IgG2a比值而预防哮喘的另一候选菌株。

解婷等[29]给小鼠口服免疫不同亲和力屋尘螨抗原Der p2重组耻垢分枝杆菌，末次免疫后第14、28、56天分别用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定小鼠血清和脾淋巴细胞培养上清液中IFN-γ、IL-2及IL-4的含量，结果IFN-γ、IL-2逐渐升高，IL-4逐渐降低，8周时更明显。这些改变在添加联合空肠弯曲菌外膜蛋白的重组菌组比仅有屋尘螨抗原的重组菌组更明显。体外Der p2刺激后，野生耻垢分枝杆菌组无明显变化，另2组变化明显。表明不同亲和力Der p2重组耻垢分枝杆菌经口服免疫均能诱导Th1型免疫应答，且含Der p2的重组菌诱导产生的Th1型优势应答具有Der p2抗原特异性，弥补了黏膜型疫苗低亲和力的不足。

3.3 耻垢分枝杆菌与寄生虫病防治研究

抗原虫的免疫机制较复杂，增加了原虫疫苗研究的复杂性，而以耻垢分枝杆菌为载体的原虫抗原重组表达能使相应问题简化。

李俊华等[30]依据疫苗防治疾病的经验，拟研制廉价、安全、有效的弓形虫疫苗。该课题组诱导弓形虫RH株致密颗粒蛋白4(dense granule protein 4，gra4)基因在耻垢分枝杆菌中表达：用PCR从RH株DNA中扩增该基因，克隆构建载体质粒，电转化gra4基因片段至耻垢分枝杆菌中。用该重组菌免疫小鼠，蛋白免疫印迹法检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体，以鉴定重组蛋白的抗原性。结果显示，该重组菌能表达重组蛋白GRA4，具有刺激小鼠产生抗弓形虫抗体的抗原性。

疟疾是严重危害人类健康的感染性疾病。其中间日疟长期被忽视，但其可反复发作并引起严重并发症，因此有效的疫苗开发是控制和消灭间日疟原虫感染的有效途径。间日疟原虫裂殖子主要蛋白1(pvMSP1)表达于疟原虫裂殖子表面，该跨膜糖蛋白MSP1-19片段位于胞外区，与间日疟原虫入侵人类红细胞过程关系紧密。陈勇等[31]用PCR体外扩增pvMSP1-19，克隆构建载体质粒，电转化至耻垢分枝杆菌中，热诱导此重组耻垢分枝杆菌，SDS-聚丙 烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)后观察pvMSP1-19蛋白表达，蛋白免疫印迹法鉴定其免疫学活性。结果证实，构建的重组耻垢分枝杆菌能表达具有免疫反应的pvMSP1-19蛋白。

杜氏利什曼原虫感染的发生与病原体诱导的Th1/Th2平衡偏离有关，疾病严重程度主要取决于IL-12和IL-10的产生。用耻垢分枝杆菌脂阿拉伯甘露糖干预杜氏利什曼原虫感染小鼠的巨噬细胞，观察小鼠巨噬细胞中蛋白激酶信号级联调节宿主效应的应答能力。结果表明，脂阿拉伯甘露糖通过影响杜氏利什曼原虫感染的巨噬细胞的多种信号通路，诱导Th2极化所需的细胞因子表达[32]。

3.4 耻垢分枝杆菌与病毒感染性疾病疫苗研究

耻垢分枝杆菌亦用于研究病毒感染所致疾病机制的研究。

胡兴斌等[33]探索了耻垢分枝杆菌运载乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关抗原的可行性。结果显示，重组耻垢分枝杆菌免疫组抗体效价峰值高于DNA疫苗免疫组，且维持时间更长；前者诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖刺激指数及特异性细胞毒性T细胞杀伤率均显著高于DNA疫苗免疫组。结果证实，重组耻垢分枝杆菌可在小鼠体内诱导产生细胞免疫应答，与DNA基因疫苗相比，重组耻垢分枝杆菌活菌免疫策略具有一定优势。

Ahmed等[34]用耻垢分枝杆菌等细菌评估了机体共生菌对人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)感染的可能影响。结果显示，革兰阴性菌可通过激活Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)及其下游Ⅰ型干扰素信号通道而抑制HIV-1复制，而耻垢分枝杆菌等革兰阳性菌无此作用。

4 结语

综上所述，耻垢分枝杆菌因其非致病性特性，在抗结核分枝杆菌研究中发挥着独有的作用，主要集中于通过转基因方式对结核分枝杆菌相应蛋白进行功能诠释、耐药基因及新型抗结核分枝杆菌疫苗的研究。尤其是耻垢分枝杆菌在新疫苗研究中的应用，使人们对疫苗的界定产生了新的思考。同时，由于相应的免疫学特性，其在非分枝杆菌感染和免疫性疾病的研究中也崭露头角。

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