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环氧合酶-2和核因子-κB在脓毒症大鼠肝损伤中的表达

2014-03-17刘丽平

中国医药导报 2014年8期
关键词:合酶阳性细胞脓毒症

李 斌 刘丽平 郭 鸿 李 汛

兰州大学第一医院重症医学科,甘肃兰州730000

环氧合酶-2和核因子-κB在脓毒症大鼠肝损伤中的表达

李 斌 刘丽平 郭 鸿 李 汛

兰州大学第一医院重症医学科,甘肃兰州730000

目的探讨环氧合酶2(COX-2)和核因子-κB(NF-κB)在脓毒症大鼠的肝组织炎性反应中的表达及其相互关系。方法随机选择54只200~220 g成年Wistar大鼠分为3组,假手术A组(实验开始前2 h腹腔内注射生理盐水,麻醉后行开腹手术,不做模型诱导,n=6);脓毒症模型B组[实验开始前2 h腹腔内注射生理盐水,麻醉后盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)建立腹腔感染模型,n=24];NS398干预C组(CLP建立腹腔感染模型,实验开始前2 h腹腔内注射NS398 10 mg/kg,n=24)。以CLP法建立动物模型,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测COX-2 mRNA在肝脏组织的表达,免疫组织化学法(Elisa)测定NF-κB在肝细胞中表达,并检测肝脏功能,如谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和肝脏大体标本及病理变化。结果①COX-2 mRNA在A组呈低表达(1040.82±2.77),各时点C组较B组明显降低。②肝细胞中NF-κB在A组表达较低[3 h:(0.60±0.54),6 h:(0.60±0.54),12 h:(0.60±0.54),24 h:(0.60±0.54)],脓毒症后其表达明显增高[3 h:(2.60±0.55),6 h:(7.20± 1.09),12 h:(12.20±0.32),24 h:(6.40±0.73)];在同一时点比较,B组低于C组[3 h:(1.60±1.89),6 h:(6.60±0.79),12 h:(9.20±2.68),24 h:(4.80±1.60)](P<0.05)。③Pearson相关分析,COX-2 mRNA与NF-κB呈直线正相关(r= 0.685,P=0.042)。④脓毒症后肝脏转氨酶明显增高[ALT:3 h:(174.00±18.73)U/L,6 h:(204.67±23.59)U/L,12 h:(311.00±44.53)U/L,24 h:(506.67±24.79)U/L;AST:3 h:(619.67±145.81)U/L,6 h:(594.00±34.59)U/L,12 h:(1027.66±136.21)U/L,24 h:(1518.33±139.38)U/L],NS-398干预后降低[ALT:3 h:(105.33±18.01)U/L,6 h:(157.00±32.36)U/L,12 h:(101.00±16.52)U/L,24 h:(93.33±10.41)U/L;AST:3 h:(217.00±26.21)U/L,6 h:(461.33± 22.01)U/L,12 h:(322.00±72.33)U/L,24 h:(268.00±98.57)U/L],C组与B组差异有统计学意义(P<0.05),提示经干预肝脏病理损伤减轻。结论COX-2在脓毒症后引起的肝损伤中占有重要地位,NS-398通过特异性抑制COX-2来抑制肝细胞中NF-κB的表达,从而减轻肝细胞损伤。

脓毒症;COX-2;NS398;肝损伤;NF-κB

脓毒症(sepsis)是ICU最为常见的疾病,常常继发于严重创伤、烧伤、休克、大手术后,而脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(MODS)等是其进一步发展而来的,已成为当今外科ICU首要死亡原因[1-2],而肝脏是最常受累的器官之一。核因子-κB(NF-κB)是炎症和免疫应答中的关键因素,能够在基因水平调控一些致炎症细胞因子和诱生型酶,如环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)、一氧化氮合酶(iNOS)等的表达[1-3]。COX-2一般在正常组织较少表达,它主要表达在一些与炎症有密切关系的细胞或组织上,在炎症因子和(或)细胞因子等的刺激下大量表达,参与和加重炎性反应,且其表达水平与炎症的严重程度相关[4-6]。国内外对于NF-κB和COX-2在脓毒症后肝损伤中的作用及相互关系报道不多,所以本研究试图通过建立脓毒症后肝组织炎性反应模型,研究二者在其中的表达和相互关系,探索保护肝细胞的新方法。

1 材料与方法

1.1 实验分组和给药方法

体重200~220 g Wistar雄性大鼠54只(购于兰州大学动物实验中心),称重后随机分为3组:假手术A组(实验开始前2 h腹腔内注射生理盐水,麻醉后行开腹手术,不做模型诱导,n=6);脓毒症模型B组(实验开始前2 h腹腔内注射生理盐水,麻醉后CLP建立腹腔感染模型,n=24);NS398干预C组(CLP建立腹腔感染模型,实验开始前2 h腹腔内注射NS398 10 mg/kg,n=24)。将B、C两组根据取材时间不同又分为4组,每组6只。除干预措施不同外,其余喂养相同,分别于造模后3、6、12、24 h,假手术组在术后6 h抽取大鼠门静脉血标本,用于检测肝功能,包括谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST);取肝组织观察病理学改变、免疫组织化学染色和RT-PCR。

1.2 动物模型的建立

盲肠结扎穿孔(cecalligation and puncture,CLP)腹腔感染模型建立参照Flammand等[7]的方法。实验前动物禁食12 h,自由饮水,腹腔内注射1%氯胺酮10 mL/kg,麻醉成功后,无菌操作,腹正中2 cm切口进腹,于盲肠出口处用4号线结扎,18G套管针将盲肠贯通穿孔一次,穿孔为两个,挤出少量肠内容物,还纳肠管于腹腔,间断缝合腹壁。术后各组动物均自由进食饮水。

1.3 主要药物和试剂

NS398购于Sigma公司,NF-κB p65免疫组化试剂盒、SABC试剂盒购于武汉博士德公司,Trizol柱式RNA抽提试剂盒、AMV cDNA第一链合成试剂盒为上海生工公司产品,2×HotStart Taq PCR Mastermix试剂盒为北京天为时代公司产品。

1.4 检测指标和方法

1.4.1 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)观察COX-2 mRNA水平变化①取-80℃冰箱保存肝组织50μg,用Trizol柱式总RNA抽提试剂盒提取总RNA,并检测纯度和完整性。②RT-PCR(二步法,按照说明书操作):引物序列(5′→3′):COX-2上游引物CTG TAT CCC GCC CTG CTG GT;下游引物GAG GCA CTT GCG TTG ATG GT[8];产物287 bp。β-actin(内参照)上游引物GAT GGT GGG TAT GGG TCA GAA;下游引物CTA GGA GCC AGG GCA GTA ATC;产物839 bp(均由上海生工公司合成)。反应条件:94℃预变性3 min,然后按94℃30 s,50℃30 s,72℃1 min进行28个循环,最后72℃延伸10 min。PCR产物6μL,在1.8%琼脂糖胶上电泳,EB染色,凝胶成像仪照相记录。分析结果以COX-2与相应β-actin条带灰度(IOD)之比值Q表示(Q=IODCOX-2/IODβ-actin),用Quantity One 4.0图像分析软件分析IOD。

1.4.2 肝细胞NF-κB表达的测定采用Elisa法(免疫组织化学法)肝组织标本经10%福尔马林固定,石蜡包埋,4μm切片,分别做HE和NF-κB免疫组化标记,采用SABC法,按试剂盒说明书进行。经DAB显色后,苏木精复染,中性树胶封固。用已知的阳性片作为阳性对照,每组均用PBS代替一抗作阴性对照。所有切片均在同一条件下的显微镜下观察,结果以胞质或胞核中发现棕黄色颗粒或褐色颗粒为阳性细胞,阴性对照则无棕黄色反应产物。取光学显微镜下每平方毫米视野(20×或40×)中的阳性细胞数,随机选择5个视野,其中每平方毫米内的平均阳性细胞数作为计数标准。采用以下评分标准[9]。染色强度分为4级:0级:阴性,1级:弱阳性染色,2级:中度阳性,3级:强阳性染色。每张切片按所见阳性细胞范围分为5级:0级:阴性,1级:1%≤阳性细胞≤25%,2级:25%<阳性细胞≤50%,3级:50%<阳性细胞≤75%,4级:75%<阳性细胞≤100%,每张切片的染色积分以两者之和表示。

1.4.3 肝功能检测用日立7020全自动生化分析仪检测肝功能指标ALT、AST。

1.4.4 超微结构观察TEM-1230透射电镜观察肝脏超微结构改变。

1.5 统计学方法

所得实验数据均由SPSS 13.0软件分析,实验数据满足方差齐性时,采用均数±标准差(x±s)描述,多组比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)方法,组间两两比较采用Bonfferoni法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR观察COX-2在不同组、不同时间变化结果

由图像软件分析相应条带后可知:肝组织中COX-2 mRNA在假手术组呈低表达(1040.82±2.77);CLP造模后3 h表达明显增强(2064.04±6.78),到6 h达到高峰(3992.45±16.75),12、24 h仍呈高表达[(2916.80±6.79),(2237.80±7.42)]。NS398干预后各时点COX-2 mRNA表达较脓毒症组显著降低,但是仍然高于假手术组。见图1。

图1 COX-2在不同组、不同时间变化结果

2.2 大体及病理检查结果

2.2.1 假手术组肉眼观察,肝脏无明显改变。肝脏红润,无血性腹水及坏死灶。

2.2.2 脓毒症组各时间点大鼠剖检均可见不同程度的血性腹水,肠管扩张,并可见散布于盲肠、大网膜、肠系膜等处出血、坏死灶和皂化斑。肝脏大小无明显改变,颜色呈暗红色,表面可见散在的点状淤血。电镜下3 h组可见肝细胞核基本正常,Diss间隙增宽,溶酶体增多,线粒体扩张(图2)。6 h组可见肝细胞核固缩、畸形,内质网减少,线粒体嵴断裂、髓鞘样改变,并有肥大细胞、巨噬细胞和浆细胞浸润(图3)。12 h组和24 h组可见细胞变形,血窦扩张,肝细胞核固缩、染色质呈块状、核膜不清,线粒体、内质网明显减少,内质网扩张、脱颗粒,胆小管闭塞、绒毛消失(图4、5)。

2.2.3 NS398干预组除3 h组外,其余各组可见少量血性腹水,肠管轻度扩张,盲肠处可见出血坏死,无灶化斑。肝脏色泽稍暗,未见出血点。电镜下3 h组与脓毒症3h组变化基本相同(图6)。6 h组Diss间隙增宽,核染色质边集,内质网减少,线粒体扩张,未见细胞浸润(图7)。12 h和24 h组可见溶酶体增多,内质网和线粒体仅见个别扩张,个别核膜不完整、染色质边集(图8、9)。

图2 脓毒症组3 h(12 000×)

图3 脓毒症组6 h(25 000×)

图4 脓毒症组12 h(20 000×)

图5 脓毒症组24 h(20 000×)

图6 NS398干预3 h组(15 000×)

图7 NS398干预6 h组(2 0000×)

图8 NS398干预12 h组(12 000×)

图9 NS398干预24 h组(12000×)

2.3实验大鼠在同一时间段ALT、AST变化

结果显示,CLP造模后脓毒症组ALT、AST含量显著增高,到24 h含量最高,各时段与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05)。而NS398干预组ALT、AST含量也增高,在3、12、24 h,与假手术组差异无统计学意义(P>0.05);相同时段比较,ALT、AST与脓毒症组差异有统计学意义(P<0.05)。这与COX-2 mRNA变化基本相同。见表1。

表1 各组ALT、AST变化比较(U/L,x±s)

2.4 在同一时间段大鼠NF-κB变化

肝细胞中NF-κB在假手术组呈低表达;CLP造模后3 h表达增强,到12 h达到高峰,24 h仍呈高表达。NS-398干预后相同时点NF-κB表达较脓毒症组显著降低,但是仍然高于假手术组(P<0.05)。这与COX-2 mRNA变化基本一致,Pearson相关分析,COX-2 mRNA与NF-κB呈正相关(r=0.685,P= 0.042)。见表2。

表2 各组NF-κB变化比较(U/L,x±s)

3 讨论

脓毒症时机体各个重要器官都有可能受到炎症波及,而肝脏是炎性反应最为剧烈和最容易受到损伤的器官之一,内毒素(LPS)通过直接或间接作用造成肝损伤,其中细胞因子、氧自由基等发挥重要作用[10]。肝损伤的就是各种致病因素作用于肝组织,肝细胞在一定程度上出现变性、坏死和功能性变化。作为重要炎症介质,前列腺素在肝损伤中的细胞因子网络中发挥重要作用。COX是合成各种前列腺素(prostaglandins,PGs)的关键限速酶,在肝损伤时,激素、细胞因子、内毒素和促癌剂等诱导COX-2的表达,氧化应激与脂质过氧化的代谢产物也可诱导COX-2表达参与肝损伤[11]。但是COX-2在肝损伤后高表达,究竟是对肝组织的保护性因素还是损伤性因素,其作用机制如何,目前尚不完全清楚,而且一直存在争议。一些实验研究认为,抑制COX-2表达,不仅可以降低血中炎症细胞和其他有害因子水平,减轻脓毒症症状,从而抵御内毒素介导的感染和死亡,降低病情严重程度。其中的机制可能与COX-2抑制剂能阻碍NF-κB的激活有关。

NF-κB由p50和p65两个亚基组成,只有p65在蛋白的C末端含有转录激活区域能直接作用于转录区域而激活转录过程,因此,可通过测定NF-κB亚单位p65反映NF-κB的活性[12]。近年来研究发现COX-2的基因中含有2个NF-κB位点序列:5-GGG ACT TTC C2-3′,分别位于-445/-427和-223/-214处,该位点序列发生定向突变后,几乎完全封闭TNF-α对COX-2启动子连接的报告基因活性的诱导作用[13]。而且有研究表明COX-2抑制剂发挥抗炎和抗增殖作用主要与抑制转录因子NF-κB或AP-1相关[14]。二者的相互关系如何,相互之间的作用机制如何,所以在前人研究的基础上,笔者假设通过反馈调节机制,可以抑制COX-2 mRNA来减弱NF-κB的表达。

本研究采用经典的CLP,制造与临床感染相似的脓毒症动物模型。结果表明脓毒症之后肝组织炎性反应剧烈,肝脏功能迅速变化,转氨酶快速升高,而且病理变化显著,肝细胞出现变性坏死,这提示已造成一定程度的肝损伤。本研究中笔者观察发现,在没有明显脓毒症的假手术组NF-κB表达较低(0.60±0.54),而在脓毒症B组,3 h后NF-κB表达显著增高,12 h时达到高峰(12.20±0.32),24 h仍然高表达。与此同时,脓毒症后早期肝组织COX-2 mRNA表达即增高,24 h时仍呈高表达,这个变化与NF-κB变化相一致。这说明NF-κB参与脓毒症肝损伤过程,而NF-κB的活化促进了COX-2 mRNA的表达,而且COX-2 mRNA的表达增高可能是造成机体损伤的一种有害机制。当使用COX-2特异性抑制剂NS-398干预后,COX-2 mRNA表达明显降低,肝功能及肝细胞病理损伤明显好转,同时段NF-κB较脓毒症组降低(P<0.05)。Pearson相关分析,COX-2 mRNA与NF-κB呈正相关(r=0.685,P=0.042)。Strong等[15]的研究结果也表明:NS398通过抑制PGE2和COX-2 mRNA表达,从而明显降低致炎症细胞因子产物水平,提高宿主存活率。这些变化使我们有理由相信,选择性COX-2抑制剂在抑制COX-2 mRNA表达的同时,通过负反馈调节机制,减弱NF-κB的表达,从而改善肝损伤,有效保护肝细胞。

通过实验研究表明,COX-2在脓毒症后引起的肝损伤中占有重要地位,NS-398通过负反馈调节机制,特异性抑制COX-2来抑制肝细胞中NF-κB的表达,从而减轻肝细胞损伤。

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Express of cyclooxygenase-2 and NF-κB for hepatocellular injury in rats with sepsis

LI Bin LIU Liping GUO Hong LI Xun
Intensive Care Units,the First Hospitalof Lanzhou University,Gansu Province,Lanzhou 730000,China

ObjectiveTo study the expression of cyclooxygenase 2 and NF-κB on hepatic inflammatory reaction of rats with sepsis and their interrelation.Methods54 Wistar rats(200-220 g)were randomly divided into 3 groups.A:sham group(with saline injected into intraperitoneal 2 h before the experiment,and operation after anesthesia,no-maked model induced,n=6);B:sepsis model group(with saline injected into intraperitoneal 2 h before the experiment,and to make sepsis model after anesthesia by using CLP,n=24);C:NS-398 intervention group(to make sepsis model by using CLP,NS398 10 mg/kg injected into intraperitoneal 2 h before the experiment,n=24).Animal model was established with cecum ligation perforation(CLP)method.RT-PCR were used to determine COX-2 mRNA expression in liver tissue,NF-κB of hepatocyte was detected by immunohistochemical method.At the same time,ALT,AST and liver pathological changes were detected.Results①The expression of COX-2 mRNA were lower in group A(1040.82±2.77), higher in group B than C at the same time.②The expression of NF-κB were lower in hepatocyte in group A[3 h: (0.60±0.54),6 h:(0.60±0.54),12 h:(0.60±0.54),24 h:(0.60±0.54)],but higher after CLP[3 h:(2.60±0.55),6 h:(7.20± 1.09),12 h:(12.20±0.32),24 h:(6.40±0.73)],but were higher in group B than in group C[3 h:(1.60±1.89),6 h:(6.60± 0.79),12 h:(9.20±2.68),24 h:(4.80±1.60)]at the same time(P<0.05).According to Pearson correlation analysis,it was positive correlation between cyclooxygenase-2 mRNA and NF-κB(r=0.685,P=0.042).③Serum ALTand AST weresignificantly increased in B[ALT:3 h:(174.00±18.73)U/L,6 h:(204.67±23.59)U/L,12 h:(311.00±44.53)U/L,24 h: (506.67±24.79)U/L;AST:3 h:(619.67±145.81)U/L,6 h:(594.00±34.59)U/L,12 h:(1027.66±136.21)U/L,24 h: (1518.33±139.38)U/L]than group C[ALT:3 h:(105.33±18.01)U/L,6 h:(157.00±32.36)U/L,12 h:(101.00±16.52)U/L, 24 h:(93.33±10.41)U/L;AST:3 h:(217.00±26.21)U/L,6 h:(461.33±22.01)U/L,12 h:(322.00±72.33)U/L,24 h:(268.00± 98.57)U/L],but significantly decreased in group C than group B(P<0.05).Those prompted Hepatic pathologic injury extenuate after intervention.ConclusionCOX-2 plays an important role in hepatic injury by sepsis,NS-398 can peculiarly inhibitthe expression of NF-κB by inhibiting COX-2,thus relieves injury of hepatocyte.

Sepsis;Cyclooxygenase-2;NS398;Hepatic injury;NF-κB

R631.3

A

1673-7210(2014)03(b)-0014-05

2013-11-11本文编辑:卫轲)

李斌(1972.9-),男,山西交城人,硕士,副主任医师;研究方向:重症医学。

李汛(1972.12-),男,甘肃成县人,博士研究生,主任医师,教授,主要从事普通外科、重症医学方面的研究。

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