银杏内酯注射液细菌内毒素检查法的探讨

李婧, 孙文霞

（1.西南民族大学, 四川 成都 610041; 2.成都大学四川抗菌素工业研究所, 四川 成都 610051)

银杏内酯注射液细菌内毒素检查法的探讨

李婧1, 孙文霞2

（1.西南民族大学, 四川 成都 610041; 2.成都大学四川抗菌素工业研究所, 四川 成都 610051)

目的: 建立银杏内酯注射液的细菌内毒素检查法, 保证其安全性. 方法: 按照《中国药典》2010 年版二部中细菌内毒素检查法, 确定银杏内酯注射液的细菌内毒素限值, 并对3批样品进行检查. 结果 将银杏内酯注射液稀释15倍对细菌内毒素检查无干扰作用, 其细菌内毒素限值可定为1.5 EU/mg. 结论: 所建立的方法快速、简便、具有可行性,可用于控制银杏内酯注射液中细菌内毒素的量.

银杏内酯注射液；细菌内毒素检查；鲎试剂

银杏叶提取物是治疗心脑血管疾病的首选天然药物, 广泛用于治疗心脑血管疾病, 是全球使用量最大的植物药, 具有卓越的疗效和安全性. 银杏内酯是银杏叶提取物最重要的有效成分. 银杏内酯注射液的主要活性成分为银杏总内酯（ginkgolide), 由倍半萜内酯和二萜内酯组成, 具有很强的抗血小板活化因子活性[1-4]. 具有活血化瘀、通经活络的功效, 用于中风病中经络恢复期淤血阻络症如半身不遂, 口舌歪斜, 肢体麻木等, 适用于急性期脑梗死和恢复期脑梗死患者, 有很好的开发应用前景. 本实验按照《中国药典》[5]2010年版二部“附录XI E 细菌内毒素检查法（凝胶法)”和“附录XIX F细菌内毒素检查法应用指导原则”, 以及2005年版《中国药品检验标准操作规范》[6]中细菌内毒素检查法的要求, 对银杏内酯注射液的细菌内毒素检查法进行了考察, 为银杏内酯注射液的质量控制提供参考. 现介绍如下.

1 实验材料

1.1 试药与试剂

BET用水（细菌内毒素检查用水): 批号1101040, 规格5 ml/支, 由广东湛江安度斯生物有限公司提供. CSE (细菌内毒素工作标准品): 批号为150601-201069, 规格为120 EU/支, 由中国药品生物制品检定所提供. 灵敏度为0.5 EU/ml的鲎试剂(TAL): 批号为100101, 规格为0.1ml/支, 由湛江安度斯生物有限公司提供；批号为1101140, 规格为0.1ml/支, 由湛江博康海洋生物有限公司生产. 银杏内酯注射液: 规格10mg/2ml, 批号110801、110802、110803, 自制.

1.2 仪器

202-I型电热恒温干燥箱(上海产), Vortex-Genie 2/2T型旋涡振荡器(美国 Scientific Industries), 19A型恒温水浴系统（德国Julabo公司). 所有玻璃器皿均在250°C下干燥2h.

2 方法与结果

2.1 鲎试剂灵敏度复核

根据鲎试剂的标示灵敏度, 用BET水将CSE稀释成 2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25 λ 4个浓度, 按2010年版《中国药典》依法操作. 每一浓度平行做4支, 同时用BET水做2支阴性对照, 并按式λC= antilg（∑X/4)计算λC值.根据中国药典二部的要求: 当λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ)时, 方可用于细菌内毒素检查. 结果CSE浓度为2.0λ的反应管均呈阳性反应, CSE浓度为0.25 λ的反应管和阴性对照管均呈阴性反应, 可见所采用的2批灵敏度为0.5EU/ml的鲎试剂可用于细菌内毒素检查, 见表1.

表1 鲎试剂灵敏度复核结果Tab. 1 Sensitivity recheck results of TAL

2.2 细菌内毒素限值（L)的确定

本品拟临床用法为: 静脉滴注. 每次5支, 临用前加于250毫升0.9%氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液中缓慢静滴, 一日1次. 依据公式L=K／M, 式中 K为5.0 EU /kg·h, 表示人每公斤体重每小时可接受的内毒素最大剂量；M 表示人用每公斤体重每小时给药的最大剂量, 本品按照50 mg银杏内酯与250ml氯化钠注射液( 限值为0.5 EU/ml) 静脉滴注1h计. (50*L+250*0.5)/60 kg·h=5 EU /kg·h, L= 3.5 EU /mg, 为了保证临床用药安全, 从严考虑, 将本品的限值定为 1.5 EU /mg.

2.3 干扰初筛试验

2.3.1 供试品的稀释

最大有效稀释倍数MVD=cL/λ, L为1.5 EU /mg, 银杏内酯注射液的浓度c为5mg/ml. 分别计算出灵敏度为0.5, 0.25, 0.125, 0.06 EU/ml的TAL相应的MVD, 用BET水将银杏内酯注射液按照以上4个稀释倍数进行稀释, 备用.结果见表2.

表2 不同λ鲎试剂所对应的MVD结果Tab. 2 MVD for different TAL

2.3.2 供试品干扰初筛试验

取λ为 0.5 EU/ml的TAL 16支, 其中8支分别用 “2.3.1”项下的4个浓度的供试品溶液0.1 m1复溶, 再分别加入0.1 ml BET水, 每个浓度 2 支反应管, 作为供试品阴性对照反应管, 记作NPC；另外8支先分别用4个上述浓度的供试品溶液复溶, 再分别加入2λ即1.0 EU/ml的内毒素溶液0.1 ml, 每个浓度 2 支反应管, 作为供试品阳性对照反应管, 记作PPC. 结果NPC均显阴性, PPC均显阳性反应, 说明供试品在稀释15到120倍的浓度下应该对细菌内毒素与鲎试剂的凝集反应无干扰作用. 结果见表3.

表3 干扰初筛试验结果Tab. 3 Results of preparative interference test

2.4 供试品干扰确证试验

选取2个不同厂家的灵敏度为0.5 EU/ml的鲎试剂, 用BET水分别把3批供试品稀释15倍, 每一浓度平行做 4管, 同时用BET水做2支阴性对照（NC), 放入37±1℃的恒温器中孵育60±2分钟, 观察结果, 并按Es=antilg（∑X/4),计算Es和 Et. 见表4.

结果Es和Et均在 0.5λ～2.0λ 之间, Et/Es的值为 0.5～2.0 , 认为银杏内酯注射液在稀释15倍的浓度下对灵敏度为0.5 EU/ml的鲎试剂与细菌内毒素的凝集反应无干扰作用.

2.5 供试品细菌内毒素检查

用BET水把3批银杏内酯注射液稀释15倍, 用灵敏度为 0. 5 EU/ml 的鲎试剂进行检查. 结果表明3批银杏内酯注射液的细菌内毒素检查结果均符合要求. 见表5.

表4 干扰性试验的结果Tab. 4 Results of interference test

表5 3批供试品的细菌内毒素检查结果Tab. 5 Bacterial endotoxins detection results of Ginkgolide injection

3 讨论与结论

银杏内酯主要包括银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内脂M、银杏内脂J以及白果内酯等有效成分, 这些成分具有广泛的药理活性, 如抗血管性痴呆[3], 抗血小板活化因子（PAF)作用, 因而可用于防治动脉粥样硬化, 抗心肌缺血和缺血再灌注损伤作用, 减轻老年痴呆症状等[7-11]. 银杏内酯B是钙通道和血小板活化因子的拮抗剂, 具有抗氧化作用吧, 它可以减轻脑水肿, 改善局部脑微循环, 减少脂质过氧化反应, 从而保护脑组织免受损伤[12-13]. 银杏注射液具有降低血液粘滞度, 改善微循环, 减少尿白蛋白, 保护肾功能等作用[14]. 因而银杏内酯资源的开发和应用一直是中草药研究的热点.

细菌内毒素检查法是利用鲎试剂检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素, 以判断供试品中存在的细菌内毒素的限量是否符合规定的方法, 包括凝胶法和光度测定法, 具有方便、快捷、灵敏和经济等优点, 目前越来越多的品种采用细菌内毒素检查法来控制注射制剂的质量. 细菌内毒素检查必须排除外源性内毒素干扰, 所以试验所用的玻璃器皿等均应进行高温处理除去可能存在的外源性内毒素, 先用自来水将其洗干净并烘干水分, 然后用洗液浸泡4小时, 再用自来水将残余的洗液洗净, 最后用新鲜蒸馏水冲洗, 置适宜的密闭金属容器中迅速置烤箱中. 禁用超纯水或久置的蒸馏水冲洗, 因为纯化水中存在的阴阳离子经250℃高温干烤不能完全被破坏, 会对鲎试剂酶反应抑制或增强的反应.

白林等人[15]对银杏内酯B注射液的细菌内毒素检查法进行了研究, 银杏内酯B注射液的临床用法用量为,成人 1 次 将40 mg加到500 ml氯化钠注射液中, 静脉滴注, 在计算限量时将500 ml氯化钠注射液的内毒素限量扣除, L氯化钠为0.5 EU·m1, 笔者参考该了文献, 将银杏内酯注射液的细菌内毒素限值定为1.5 EU/mg. 干扰初筛试验是药品与鲎试剂相容性的筛选试验, 通过对一系列含2λ内毒素浓度的样品溶液与鲎试剂的反应, 初步筛选出对鲎试验无干扰的浓度, 可减少干扰试验的盲目性. 实验结果Es和Et均在 0.5λ～2.0λ 之间, Et/Es的值为0.5～2.0, 认为银杏内酯注射液在稀释15倍的浓度下对灵敏度为0.5 EU/ml的鲎试剂与细菌内毒素的凝集反应无干扰作用. 银杏内酯注射液可采用细菌内毒素检查法进行检查.

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Bacterial endotoxins test for Ginkgolide Injection

LI Jing1, SUN Wen-xia2
(1. Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.; 2. Sichuan Industrial Institute of Antibiotics, Chengdu University, Chengdu 610051, P.R.C.)

Objective: To establish a method to test bacteria1 endotoxin of Ginkgolide Injection．Methods: Referencing appendix ofChina Pharmacopoeia2010 edition, the method to test bacteria1 endotoxin for Ginkgolide Injection is researched．Result: It is proved that the product does not interfere with endotoxin, and the limit of bacterial endotoxin is 1.5 EU/mg．Conclusion: Bacteria endotoxins test can be feasibly done for Ginkgolide Injection.

Ginkgolide Injection；bacterial endotaxins test；tachypleus amebocyte lysate

R927.1, R93

A

1003-4271(2014)05-0715-04

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.05.15

2014-04-09

李婧(1985-), 女, 汉族, 四川人, 实验师. Email:27918716@qq.com.

孙文霞(1980-), 女, 汉族, 河北人, 助理研究员. Email: 39512193@qq.com.