甘草酸二胺对腹膜透析大鼠腹膜功能的影响

卫志锋，李 多，陆继芳，刘圣君，李素敏

(1.河北北方学院附属第一医院肾内科，河北 张家口 075000；2.河北北方学院附属第一医院消化内科，河北 张家口 075000；3.河北医科大学第二医院肾内科，河北 石家庄 050000)

全世界目前拥有大约13万肾脏病患者接受腹膜透析治疗，但有近50%的患者在开始治疗后的5年内停止腹膜透析治疗，其中腹膜纤维化引起的腹膜超滤衰竭是腹膜透析患者退出腹膜透析的主要原因。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在腹膜结构和功能的改变中起着非常重要的作用，有研究[1]报道VEGF的上调参与了腹膜毛细血管的重塑。本研究探讨甘草酸二胺对腹膜透析大鼠腹膜功能的影响，并检测血液及透析液中VEGF的浓度，了解其是否与大鼠腹膜功能相关，旨在为今后的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物：选用雄性SD大鼠50只，体质量150～200g，由河北北方学院动物室提供。饲养条件，一笼5只，每天光照12h，室温保持24℃、相对湿度45%，大鼠的饮食及饮水在整个实验过程中不受限制。

1.2 药品及试剂：4.25%腹膜透析液(广州百特医疗用品有限公司)；己酮可可碱(武汉海特生物制药股份有限公司)；甘草酸二胺(石家庄制药集团华盛制药有限公司)；脂多糖(上海研生生化试剂有限公司)；大鼠VEGF ELISA试剂盒(武汉博士德生物科技有限公司)。

1.3 分组与给药：50只雄性SD大鼠，随机分为5组，即正常对照组、生理盐水组、模型组、己酮可可碱治疗组、甘草酸二胺治疗组，每组10只。空白对照组，不进行任何处理；生理盐水组，每日腹腔内注射0.9%氯化钠注射液20mL；模型组，每日腹腔内注射4.25%腹膜透析液20mL并于第1、3、5、8、10、12、16、19、23、26天腹腔注射脂多糖(0.6mg/kg)。己酮可可碱治疗组，每日腹腔内注射4.25%腹膜透析液20mL并于第1、3、5、8、10、12、16、19、23、26天腹腔注射脂多糖(0.6mg/kg)+己酮可可碱6mg/kg。甘草酸二胺治疗组，每日腹腔内注射4.25%腹膜透析液20mL并于第1、3、5、8、10、12、16、19、23、26天腹腔注射脂多糖(0.6mg/kg)+甘草酸二胺10mg/kg。实验过程中未发现4.25%腹膜透析液对实验大鼠有不良反应。

1.4 标本收集和观察指标：腹膜功能检查，实验进行30d后行2h腹膜平衡试验，10%水合氯醛麻醉大鼠，4.25%腹膜透析液25mL腹腔注射，留取0、4h腹膜透析液及血液标本，注射4h后沿着腹白线处剪开腹膜，留取腹腔内液体，准确测量。血液标本用5 000r/min的速度离心10min，腹透液标本用1 500r/min的速度离心5min，留取腹膜透析液上清液、血清和血浆。超滤量=(最后出水量-25)mL,采用终点法测定透析液尿素浓度(Durea),血浆尿素浓度(Purea),初始腹膜透析液葡萄糖浓度(D0),2h透析液葡萄糖浓度(D4),计Durea/Purea和D4/D0。留取血液及腹膜透析液用ELISA法观察VEGF浓度。各项数值为10只动物的平均值。应用全自动血液分析仪检测透出液的白细胞数量，同时进行白细胞计数及分类，超过1 000/mm3的大鼠,为发生腹膜炎,退出本次实验(模型组中发现2只大鼠出现腹膜炎，并退出实验)。

1.5 检测方法：将腹膜透析液标本离心机中选1 500r/min速度离心10min，血液标本选取3 000r/min速度离心15min。每孔加入标准品0.1mL，标准品为用样品稀释液等倍稀释成不同浓度的液体，37℃条件下反应90min，移去液体，不洗。加入用抗体稀释液稀释的生物素抗大鼠转化生长因子β1抗体，每孔0.1mL(1∶100)，37℃条件反应60min，0.01mol/L PBS洗涤，加入稀释液稀释的亲和素-过氧化物酶复合物，每孔0.1mL(1∶100)，37℃条件反应30min，0.01mol/L PBS洗涤,每孔加入TMB显色液0.1mL，反应15min，每孔加入TMB终止液0.1mL。用酶标仪在450nm测定OD值，零孔设为对照值，据各孔OD值计算待测VEGF的浓度。

2 结 果

2.1 腹膜功能的改变：模型组超滤量及D4/D0较空白对照组和生理盐水组明显降低，Durea/Purea明显升高(P<0.05)；己酮可可碱治疗组和甘草酸治疗组超滤量和D4/D0较模型组明显升高，Durea/Purea明显降低(P<0.05)。两治疗组以上指标差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1各组腹膜功能比较

组别只数超滤量(mL)Durea/PureaD4/D0空白对照组104.6±2.30.52±0.070.56±0.05生理盐水组104.7±2.30.53±0.060.57±0.05模型组8-6.4±2.2∗#0.88±0.11∗#0.39±0.04∗#己酮可可碱治疗组10-2.7±2.0∗#△0.67±0.09∗#△0.48±0.02∗#△甘草酸二胺治疗组10-2.6±2.0∗#△0.66±0.09∗#△0.45±0.03∗#△

*P<0.05与空白对照组比较 #P<0.05与生理盐水组比较 △P<0.05与模型组比较(q检验)

2.2 ELISA法测定血清及腹透液中的VEGF表达：血清中的VEGF水平各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；腹透液中空白对照组和生理盐水组比较差异无统计学意义(P>0.05)；模型组、己酮可可碱治疗组、甘草酸二胺治疗组透析液中VEGF的水平较空白对照组、生理盐水组升高，差异有统计学意义(P<0.05)，且己酮可可碱治疗组、甘草酸二胺治疗组较模型组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

组别只数VEGF血清腹膜透液 空白对照组10232.91±40.8733.31±9.33生理盐水组10238.91±35.4032.31±6.09模型组8256.91±45.77132.45±23.67∗#己酮可可碱治疗组10247.77±34.3468.21±9.55∗#△甘草酸二胺治疗组10250.11±32.7870.34±8.94∗#△

*P<0.05与空白对照组比较 #P<0.05与生理盐水组比较 △P<0.05与模型组比较(q检验)

VEGF：vascular endothelial growth factor

3 讨 论

腹膜透析与血液透析相比，腹膜透析能更好地保护残余肾功能，并能更好地保护心血管系统稳定性，临床上常由于各种原因使腹膜透析患者退出腹膜透析治疗，如腹膜透析液的生物不相容性、长期腹透引起透析相关性腹膜炎以及终末期肾脏病患者存在全身微炎症状态等导致腹膜纤维化[1]。炎症包括由感染引起的急、慢性腹膜炎和终末期肾病患者的全身微炎症状态，两者结合是腹膜纤维化的主要原因，最终导致超滤衰竭。新生血管增多是腹膜纤维化重要的病理机制之一，在超滤衰竭的发病机制中处于主导地位[2]。腹膜透析治疗6年以上高达89%患者出现血管病变[3]。Yoko等[3]使用一种抗血管形成药TNP-470,通过抑制实验大鼠血管及纤维母细胞的增生从而延缓大鼠腹膜纤维化。进一步说明新生血管的形成在腹膜纤维化中起一定的作用。

己酮可可碱临床上主要用于周围血管疾病的治疗，目前已有研究证实己酮可可碱有抗纤维化作用[4]，其能改善腹膜纤维化大鼠的腹膜透析效果。本研究利用己酮可可碱为药物对照，观察甘草酸二胺在腹膜纤维化中的作用。甘草酸二胺是中药甘草有效成分的第3代提取物，具有较强的抗炎、保护细胞膜的作用，该药在化学结构上与醛固酮的类固醇环相似，可阻碍可的松与醛固酮的灭活，从而发挥类固醇样作用。王磊[5]研究表明甘草酸二胺对特发性肺间质纤维化有显著的保护作用。

VEGF作为血管形成和致腹膜纤维化的主要因子，在腹膜新生血管形成和纤维化的过程中发挥各自的生物学作用，影响腹膜超滤[6-7]。Kyuden等[8]实验证明高糖能使人腹膜纤维化加重，应用VEGF拮抗剂后腹膜纤维化减轻。有研究[9-10]表明可通过下调VEGF的表达，改善糖尿病肾病时肾小球毛细血管的通透性，缓解基膜增厚，减轻细胞外基质的沉积，延缓糖尿病肾病的发展。本研究结果显示，血清中VEGF水平各组间差异无统计学意义(P>0.05)；腹透液中空白对照组和生理盐水组比较差异无统计学意义(P>0.05)，模型组与空白对照组和生理盐水组比较，VEGF明显升高(P<0.05)，己酮可可碱治疗组和甘草酸二胺治疗组较模型组VEGF明显降低(P<0.05)。表明己酮可可碱是治疗腹膜纤维化比较成功的药物，而甘草酸二胺与己酮可可碱比较，具有与其相当的疗效。VEGF水平在腹膜透析过程中升高，说明可能在腹膜纤维化过程中发挥作用，而且甘草酸二胺和己酮可可碱的干预作用可以减轻腹膜纤维化程度，其机制可能是通过降低VEGF水平来实现的。

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