WWOX基因在乳腺癌发生过程中的表达及其意义*

徐墨李壮侯燕妮李义强

WWOX基因在乳腺癌发生过程中的表达及其意义*

徐墨①李壮①侯燕妮①李义强①

目的：研究抑癌基因WWOX在乳腺癌发生过程中不同阶段的表达及乳腺癌治疗过程中的作用与意义。方法：采用免疫组化SABC法对乳腺正常组织23例、12例乳腺原位癌和45例乳腺浸润癌组织中WWOX的蛋白表达进行分析，并结合临床病理学资料进行研究。结果：26.1%（6/23）正常乳腺组织、50.0%（6/12）乳腺原位癌、64.4%（29/45）乳腺浸润癌组织中WWOX基因蛋白表达降低或缺失，各期间的差异有统计学意义（P＜0.01）。WWOX在Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级乳腺浸润癌组织分期的降低与缺失表达率分别为38.5%、61.1%和92.9%，各期间的差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：抑癌基因WWOX随着乳腺癌发生过程不同阶段中，基因表达降低或缺失逐渐升高，提示WWOX在乳腺癌发生发展过程中具有重要作用。

乳腺癌； 原位癌； WWOX基因； 抑癌基因

乳腺癌近年来发病率逐年增高，是女性常见的恶性肿瘤之一。它是一种多因素导致的疾病，自身因素、环境因素、遗传因素都有参与其发生过程。在因子水平中抑癌基因的表达有着非常重要的作用，临床已知的抑癌因子有P53、P63、Ki67等等。逐渐寻找并开发其抑癌机理成为肿瘤近年来发展趋势。Ried与Bednarek等人于2000年发现的含氧化还原酶ww结构域WWOX因子（ww domain contaming oxidoreductase），WWOX因子于人类普通的染色体脆性位点，包含FRA16D上的（16q23.3-q24.1）区域近年来被广泛认可为新的抑癌基因[1]。并且以WWOX因子的实验及文章渐渐增多，使此位点备受关注。在多种恶性肿瘤如胃肠道癌、卵巢癌、乳腺癌等都有表达减弱或趋势表现。目前多为肿瘤培养细胞或动物实验研究，WWOX因子关于乳腺癌的临床研病例究较少，本研究采用免疫组织化学SABC法检测正常乳腺组织、乳腺原位癌组织、乳腺浸润癌组织，以及在乳腺浸润癌组织分期I级、II级、III级中WWOX基因的降低或缺失表达与乳腺癌发生发展的过程的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2013年1月-2014年4月本院肿瘤外科手术切除的乳腺标本，通过查阅病例选取乳腺原位癌12例、浸润癌45例（其中病理组织学Ⅰ级16例、Ⅱ级13例、Ⅲ级16例）以及正常乳腺组织23例，被选取者为女性，均经病理科检查确诊并证实，且按国际抗癌协会标准进行分级。患者术前均无放疗、化疗等治疗。实验所用兔抗人WWOX单克隆抗体、DAB显色剂购于上海越研生物科技有限公司。

1.2 免疫组化法染色 通过查阅病例选取病理科的存档蜡块，并切片进行HE染色，然后按SABC法操作，滴加兔抗人WWOX多克隆抗体（1：100），经室温孵育2 h，再滴生物素标记的兔抗羊抗体，37 ℃ 25 min；滴加SABC复合物，37 ℃ 25 min。后经PBS缓冲液冲洗，DAB H2O2液显色，复染、脱水、透明、固定。实验步骤遵循试剂盒上说明。用已知阳性乳腺癌标本片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 染色判断 WWOX因子为细胞浆表达染色，实验以细胞浆染成棕黄色视为阳性，根据染色程度、范围来判定及评分。按程度分为：分为未染色、弱染色、强染色。按范围分为：＜30%、31%～60%、61%～100%。染色的程度乘以范围得数为评分，染色评分为1～9（染色程度为1～3，染色范围为1～3）。评分6～9认为是WWOX基因无表达缺失，2～5为表达降低，无染色为表达完全缺失；并且将结果重复观察。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行处理，计数资料采用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 WWOX基因正常在乳腺组织、原位癌及浸润癌组织中的表达 23例正常乳腺组织中，强染色表现为74.0%（17/23）（图1），染色降低为21.7%（5/23），染色缺失为4.3%（1/23）例。12例原位癌乳腺组织中，强染色表现为50.0%（6/12）（图2），染色降低为33.3%（4/12），染色缺失为16.7%（2/12）例。45例浸润癌乳腺组织中，强染色表现为35.6%（16/45）（图3），染色降低为33.3%（15/45），染色缺失为16.7% （14/45）例。三者各期间的染色表现比较差异有统计学意义（ χ2=10.319，P=0.006），见表1。

图1 WWOX因子于正常乳腺组织中表达（×40）

图2 WWOX因子于原位癌组织中表达（×40）

图3 WWOX因子于浸润癌腺组织中表达（×100）

表1 不同组织中WWOX基因的表达 例

2.2 乳腺癌中WWOX因子与临床病理学的关系 乳腺癌Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者中WWOX表达完全缺失的比例分别为38.5%、61.1%和92.9%，各期的差异有统计学意义（ χ2=7.190，P=0.027）。

3 讨论

无论国内外乳腺癌都是一种常见的疾病，目前临床乳腺癌仍以手术治疗为主，基因程度上的损伤或缺失是肿瘤发生发展的重要条件，尤其染色体脆性基因对其更敏感。所以近些年乳腺癌早期诊断及基因层面的研究逐渐兴起。WWOX基因是Ried与Bednarek等人于2000年用全基因组鸟枪法测序结合区域转录因子进行分离法发现的新抑癌基因在多种肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等的发生有关[2-3]。本文中WWOX基因约在1/3的正常乳腺组织与2/3的乳腺癌组织表达降低或缺失，结合文献报道，说明在乳腺癌的发生发展过程中WWOX基因的表达异常可能挥了重要作用。乳腺癌组织TNM分型中临床分期与WWOX基因表达也有统计学意义，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者中WWOX表达减弱或缺失的比例38.5%、61.1%和92.9%，晚期患者WWOX的减弱或缺失表达明显升高。结合WWOX因子在其他器官中癌症的类似报道研究，推测抑癌基因WWOX的缺失或异常表达在乳腺癌发生和进展中起明显作用[4-6]。且有可能成为新的临床判断乳腺肿瘤的指标，并对预后判断可能有重要意义。

[1] Bednark A，Laflin K，Daniel R，et al.WWOX， anovel ww domaincontaining protein mapping to human chromo-some 16q23.3→24.1，a region frequently affected in breastcancer[J].Cancer Res，2000，60 （15）：2140-2145.

[2] Guler G，Uner A，Guler N，et al.The fragile genes FHIT and WWOX are inactivated coordinately in invasive breastcarcinoma[J].Cancer，2004，100（8）：1605-1614.

[3] Bednark A K，Keck-Waggoner C L，Daniel R L，et al.WWOX， the FRA16D gene， behaves a suppressor of tumorgrowth[J].Cancer Res，2001，61（22）：8068-8073.

[4] Nunez M I，Rosen D G，Ludes-Meyers J H，et al.WWOX protein expression varies among ovarian carcinoma histotypes and correlations with less favorable outcome[J].BMC Cancer，2005，5（1）：64-74.

[5] Kuroki T，Yendamuri S，Trapasso F，et al.The tumor suppressor gene WWOX at jFRA16D is involved in pancreatic carcinogenesis[J]. Clin Cancer Res，2004，10（7）：2459-2465.

[6] Karoki T，Trapasso F，Shiraishi T，et al.Genetic alterations of the tumor suppressor gene WWOX in esophageal squamouscell carcinoma[J].Cancer Res，2002，62（8）：2258-2260.

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.21.010

2014-05-11） （本文编辑：蔡元元）

2011年黑龙江省教育厅科研项目（2010-496）

①佳木斯大学第一附属医院 黑龙江 佳木斯 154003

李义强