RP－HPLC法测定青蒿琥酯阿莫地喹片中主药的含量＊

2014-03-14胡志强

江苏海洋大学学报(自然科学版) 2014年2期

胡志强，蒋锋，姚忠

（1.宜兴市人民医院，江苏宜兴 214200；2.江苏鹏鹞药业有限公司，江苏宜兴 214200）

青蒿琥酯阿莫地喹片，化学名为二氢青蒿素－10－α－丁二酸单酯，分子式是C19O8H28，为具有一定水溶性的青蒿素衍生物，对对传统药物产生抗药性的恶性疟疾有着很高的活性，临床上主要用于脑性疟疾与危重疟疾患者的抢救［1］。阿莫地喹为4－氨基喹啉衍生物，通过抑制裂殖体DNA复制与转录过程，而呈现强烈的抗疟作用，临床上主要用于已发作的疟疾，也可预防其发作，并可根治恶性疟疾；此外还可以用于阿米巴肝脓肿、肺吸虫病、肝吸虫病以及某些自身免疫性疾病［2－3］。目前，盐酸阿莫地喹与青蒿琥酯联合用药，是世界卫生组织（WHO）推荐的优质抗疟药。现行只有单方片的质量标准，采用UV法测定阿莫地喹的含量，该方法繁琐，且易受到辅料及其他杂质的干扰造成误差。为更好地控制产品质量，本文建立了RP－HPLC法测定青蒿琥酯和盐酸阿莫地喹片的含量，结果表明该方法简便、准确，专属性强，有助于更好地控制本品的质量；对方法进行了验证，为制定质量标准提供了依据。

1 仪器与试剂

Sartorius BT－25S型电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司），岛津LC－20AT全自动液相色谱仪，PDA检测器，LC－Solution色谱工作站。

甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸、高氯酸为分析纯，水为纯化水。青蒿琥酯盐酸阿莫地喹片3批样品和含量测定用对照品由江苏鹏鹞药业有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 青蒿琥酯的含量

2.1.1 色谱条件色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料（安捷伦，4.6mm×15cm，5μm）；流动相，乙腈—磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾1.36g，加水1 000 mL使溶解，用磷酸调pH至3.0）（体积比42∶58）；流速1.0mL／min；检测波长210nm；进样量20μL。

2.1.2 试验方法供试品溶液的制备：取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于青蒿琥酯50mg），置50mL量瓶中，加甲醇适量，超声20 min，振摇，使青蒿琥酯溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：取青蒿琥酯对照品约50 mg，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液。

分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图和峰面积，以外标法计算含量。典型图谱如图1和图2所示。

图1 青蒿琥酯对照品溶液色谱图Fig.1 HPLC of artesunate RS

2.1.3 检测波长的选择取青蒿琥酯对照品适量用甲醇溶解并稀释制成含青蒿琥酯1.0mg／mL的溶液。以PDA作为检测器，在200～400nm的波长范围内绘制紫外吸收曲线。本品越接近200nm吸收越强，故而选择210nm作为检测波长。

图2 青蒿琥酯供试品溶液色谱图Fig.2 HPLC of artesunate test solution

2.1.4 线性关系考察取含量测定项下的青蒿琥酯对照品储备液，用流动相稀释成一系列质量浓度的溶液，浓度梯度分别为0.5，0.8，1.0，1.2，1.5和2.0mg／mL，按“2.1.1”项下色谱条件检测，以青蒿琥酯质量浓度（ρ）为横坐标，峰面积为纵坐标（y），线性回归得标准曲线。结果表明，青蒿琥酯在0.500 5～2.002mg／mL质量浓度范围内，线性关系良好，线性回归方程为y＝608 125ρ－3 311.2，r＝0.999。

2.1.5 精密度试验按“2.1.2”项下配制青蒿琥酯对照品溶液和供试品溶液，按“2.1.1”项下的色谱条件检测，连续进样6次，记录色谱图。以峰面积计算RSD为0.4%（n＝6），小于2.0%，符合要求。

2.1.6 回收率试验取处方量的辅料空白9份，置50mL量瓶中，分别精密加入青蒿琥酯对照品40，50和60mg，各质量浓度平行3份，按“2.1.1”项下的色谱条件检测。样品中青蒿琥酯含量以外标法计算，得平均回收率为98.6%，RSD为0.6%（n＝9）。

2.1.7 定量限和检测限试验取青蒿琥酯对照品溶液适量，用流动相逐级稀释，按“2.1.1”项下的色谱条件测定，记录色谱图。按信噪比10∶1计算定量限，按信噪比3∶1计算检测限。青蒿琥酯定量限为14.1μg／mL，检测限为4.70μg／mL。

2.1.8 样品检测取青蒿琥酯对照品溶液2份，色谱条件下各进3针，再取供试品溶液2份，色谱条件下进样，记录色谱图，按外标法计算含量，即得。本品3批青蒿琥酯含量结果分别为99.2%，99.3%和100.1%，符合规定。

2.2 阿莫地喹的含量

2.2.1 色谱条件色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料（安捷伦，4.6mm×15cm，5μm）；流动相，甲醇—磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾13.6g，加水溶解并稀释成2 000mL，加高氯酸2.0mL，用磷酸调pH至2.5±0.5）（体积比22∶78）；流速1.0mL／min；检测波长224nm；进样量20μL。

2.2.2 试验方法供试品溶液的制备：精密量取青蒿琥酯测定项下供试品溶液2mL置100mL量瓶中，加水稀释至刻度，作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：取阿莫地喹对照品约10 mg，精密称定，置200mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液。

分别精密量取阿莫地喹对照品溶液和供试品溶液各20μL注入液相色谱仪，记录色谱图和峰面积，以外标法计算含量。典型图谱如图3和图4所示。

图3 阿莫地喹对照品溶液色谱图Fig.3 HPLC of amodiaquine RS

图4 阿莫地喹供试品溶液色谱图Fig.4 HPLC of amodiaquine test solution

2.2.3 检测波长的选择取阿莫地喹对照品适量用水溶解并稀释制成含阿莫地喹50μg／mL的溶液，以PDA作为检测器，在200～400nm的波长范围内绘制紫外吸收曲线。本品在224nm处有最大吸收，故而选择224nm作为检测波长。

2.2.4 线性关系考察取含量测定项下的阿莫地喹对照品储备液，用水稀释成一系列质量浓度的溶液，浓度梯度分别为25，40，50，60，75和100μg／mL，按“2.2.1”项下色谱条件检测，以阿莫地喹质量浓度（ρ）为横坐标，峰面积为纵坐标（y），线性回归得标准曲线。结果表明，阿莫地喹在25.03～100.1 μg／mL质量浓度范围内，线性关系良好，线性回归方程为y＝29 695ρ＋4 493.8，r＝0.999。

2.2.5 精密度试验按“2.2.2”项下配制阿莫地喹对照品溶液和供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件检测，连续进样6次，记录色谱图。以峰面积计算RSD为0.4%（n＝6），小于2.0%，符合要求。

2.2.6 回收率试验取处方量的辅料空白9份，置50mL量瓶中，分别精密加入阿莫地喹对照品40，50和60mg，各浓度平行3份，按“2.2.1”项下的色谱条件检测。样品中阿莫地喹含量以外标法计算，得平均回收率为99.5%，RSD为0.2%（n＝9）。

2.2.7 定量限和检测限试验取阿莫地喹对照品溶液适量用流动相逐级稀释，按“2.2.1”项下的色谱条件测定，记录色谱图。按信噪比10∶1计算定量限，按信噪比3∶1计算检测限。阿莫地喹定量限为14.1μg／mL，检测限为4.70μg／mL。

2.2.8 样品检测取阿莫地喹对照品溶液2份，色谱条件下各进3针，再取供试品溶液2份，色谱条件下进样，记录色谱图，按外标法计算含量，即得。本品3批阿莫地喹含量结果分别为98.7%，99.4%和99.6%，符合规定。