EMS处理对大白菜种子萌发及主要生化指标的影响

（河北农业大学园艺学院，河北保定 071000）

EMS处理对大白菜种子萌发及主要生化指标的影响

卢 银 刘梦洋 王彦华 罗双霞 轩淑欣 赵建军 申书兴*

（河北农业大学园艺学院，河北保定 071000）

为了探讨大白菜诱变育种的新方式，研究了不同浓度EMS处理对大白菜种子萌发、幼苗生长及其主要生化指标的影响。结果表明：在0～1.0%浓度范围内，随着EMS浓度的增加，大白菜种子的发芽势、发芽率逐渐降低，幼苗根尖和叶缘褐化程度逐渐加剧，成活率下降，种子浸出液电导率以及种子和幼苗的MDA含量均逐渐增加；EMS对种子及幼苗SOD、POD活性影响表现为低浓度促进，高浓度抑制。适宜大白菜种子诱变处理的EMS浓度范围为0.4%～0.6%。

大白菜；EMS；发芽率；SOD；POD；MDA

基因突变是种质创新的根本途径，但在自然条件下基因突变率很低，人工诱变可使基因突变率提高千倍以上，甲基磺酸乙酯（ethyl methyl sulfonate，EMS）是当今应用效果最好的化学诱变剂之一，已成功地应用于多种作物的诱变育种（Wang et al.，2008；Stephenson et al.，2012），并在作物突变体库的构建和反向遗传学等基础研究中发挥了重要作用。Feiz等（2009a，2009b）利用EMS诱变技术创建了2 500株普通软质小麦突变体库，并推算每隔12 kb有1个突变发生，是目前报道突变频率最高的突变体库。Slade等（2005）应用定向诱导基因组局部突变技术（targeting induced local lesions in genomes，TILLING）从EMS诱变种子后代1 920个糯性基因小麦突变个体中筛到246个等位基因，获得了丰富的遗传信息和有价值的突变个体。在芸薹属作物中，EMS诱变研究主要针对甘蓝型油菜，关于大白菜〔Brasscia campestris L. ssp. pekinensis （Lour）Olsson〕EMS诱变研究尚无报道（和江明 等，2004；Ferrie et al.，2008；原小燕 等，2010）。本试验采用不同浓度的EMS处理大白菜种子，对种子萌发特性、电导率及种子和子叶幼苗超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）含量变化进行研究，确定适宜大白菜种子诱变处理的适宜EMS浓度，明确EMS处理对细胞膜透性及保护酶系统的影响，为大白菜诱变育种及反向遗传学等基础研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2012年8月在河北省蔬菜种质创新与利用重点实验室进行。以市售大白菜当年商品种津育80及河北省蔬菜种质创新与利用重点实验室低温保存5 a的自交系种子99-2为试材。津育80为青麻叶直筒形，中晚熟，生育期80～85 d，球顶呈花心形；99-2为筒形，球顶部合抱，中晚熟，生育期80 d左右。

1.2 方法

1.2.1 EMS处理对种子萌发的影响 挑选饱满的种子，每个品种分成6组，每组50粒，25 ℃清水浸种2 h后分别用浓度为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的EMS浸种，80 r·min-1高速震荡处理4 h，自来水冲洗2 h后转至铺有双层滤纸的培养皿中，置于培养箱中25 ℃/20 ℃（昼/夜）条件下催芽。以清水处理为对照，每处理3次重复。3 d后统计发芽势，7 d后统计发芽率，10 d后统计成活率，并记录子叶幼苗发育情况。

1.2.2 EMS处理对种子浸出液电导率的影响 挑选饱满的种子，每个品种分成6组，每组50粒，称质量；EMS处理同1.2.1，自来水冲洗2 h后，于10 mL蒸馏水中浸泡0.5 h，采用上海雷磁仪器厂生产的DDS-307型电导仪测定浸出液电导率；以静置0.5 h的蒸馏水为空白对照（毛培胜 等，2008）。

1.2.3 EMS处理对种子和幼苗POD、SOD活性及MDA含量的影响 分别用浓度为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的EMS高速震荡处理4 h、水洗2 h的种子及催芽7 d后的幼苗各1 g，进行SOD、POD活性及MDA含量测定。以清水处理为对照，3次重复。SOD活性测定采用Fridorich NBT光还原法（李合生，1999），POD活性测定采用愈创木酚法（张志良，2000），MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法（赵世杰 等，1991）。

2 结果与分析

2.1 EMS处理对大白菜种子萌发的影响

由表1可知， EMS处理对大白菜种子萌发及幼苗发育产生了抑制作用。随着EMS浓度增加，津育80和99-2的发芽势、发芽率及成活率大体呈逐渐下降的趋势，幼苗的损伤程度也逐渐加剧，表现为幼苗弱小、根尖及子叶叶缘褐化、腐烂发黑等现象。

表1 不同浓度EMS处理对大白菜种子萌发及幼苗发育特性的影响

通常以半致死剂量为适宜处理浓度，本试验中，当EMS浓度为0.4%时，99-2种子催芽10 d后的成活率为52%，且发育成植株后能正常生长；当EMS浓度为0.6%和0.8%时，津育80的成活率接近50%，但EMS浓度为0.8%的处理后期幼苗逐渐死亡，最终发育成植株的仅为27%。所以处理99-2和津育80种子的适宜EMS浓度为0.4%～0.6%。

2.2 EMS处理对大白菜种子电导率的影响

由图1可知，当EMS浓度低于0.2%时，两种大白菜种子浸出液的电导率均在5 mS·cm-1·g-1以下；当EMS浓度大于0.2%时，两种大白菜种子浸出液的电导率均随EMS浓度增加而增大；当EMS浓度为1.0%时，津育80和99-2种子浸出液的电导率分别增至108.65、268.73 mS·cm-1·g-1。说明随着EMS浓度增加，更多的细胞内物质渗漏，细胞质膜受害严重，且99-2较津育80受害程度更大。

图1 不同浓度EMS处理对大白菜种子电导率的影响

2.3 EMS处理对大白菜种子及幼苗SOD、POD活性的影响

如图2、3所示，随着EMS浓度增加，大白菜种子及幼苗SOD、POD活性均呈先增加后降低的趋势，且种子的SOD、POD活性整体高于幼苗。当EMS浓度为0.6%时，津育80种子及幼苗SOD、POD活性均达到最大值；而99-2种子及幼苗SOD、POD活性达到最大值时的EMS浓度为0.4%。

不同浓度EMS处理的99-2种子SOD活性均远远高于津育80，POD活性除0.6% 浓度处理外亦均高于津育80。99-2幼苗的SOD、POD活性基本上低于津育80，EMS浓度低于0.6%时，二者差异不大；而当EMS浓度高于0.6%时，99-2幼苗SOD、POD活性迅速下降，与津育80的差异增大。

图2 不同浓度EMS处理对大白菜种子及幼苗SOD活性的影响

图3 不同浓度EMS处理对大白菜种子及幼苗POD活性的影响

2.4 EMS处理对大白菜种子及幼苗MDA含量的的影响

由图4、5可知，随着EMS浓度的增加，两种大白菜种子和幼苗的MDA含量都呈现逐渐升高的趋势，种子的MDA含量均明显高于幼苗；且不同浓度EMS处理99-2种子和幼苗的MDA含量均高于津育80。当EMS浓度为0.4%～0.6%时，99-2种子和幼苗的MDA含量迅速增加，此后增加趋势趋于缓和；津育80种子MDA含量在EMS浓度为0.6%～0.8%时迅速增加，而幼苗MDA含量的增加趋势整体比较缓和。表明EMS处理对大白菜种子的作用效应高于幼苗，而且老化的、生理状态弱的种子受毒害时其体内有害物质的积累也高于新的、生理状态好的种子。

图4 不同浓度EMS处理对大白菜种子MDA含量的影响

图5 不同浓度EMS处理对大白菜幼苗MDA含量的影响

3 结论与讨论

高秀华等（2006）用0.2%～0.5%的EMS处理盐芥种子，发现随着EMS浓度增加M1发芽率逐渐降低，黄化嵌合苗数量也随之增加。王幼平等（1999）用EMS处理海甘蓝种子，发现低剂量EMS促进种子萌发和幼苗生长，而较高剂量EMS则降低种子发芽势和发芽率。本试验结果表明，EMS处理对两种大白菜种子萌发和幼苗发育都产生了抑制作用，且随着EMS浓度增加抑制作用增强。两份供试材料的生态型相似，但对EMS浓度反应存在差异，津育80对EMS的耐受性明显优于99-2，这可能与两份材料的生理状态有关，99-2种子存放了5 a，老化程度加剧，种子活力减弱。

突变剂引发遗传物质的变化，存在一个吸收能量的阀值，一般多以植株存活一半的剂量即半致死剂量（LD50）作为引变敏感性指标（王长里 等，2008）。本试验中，99-2和津育80种子发芽成活率约为50%时的EMS浓度分别为0.4%和0.6%，同时，0.4%和0.6%也分别是这两份材料种子SOD、POD活性达到最大、MDA含量迅速增加时的EMS浓度。因此，在大白菜种子诱变育种中，EMS处理的适宜浓度为0.4%～0.6%，处理时间为4 h。

EMS处理诱发了细胞内一系列生理生化反应，产生超氧阴离子自由基等有害大分子，而SOD、POD作为保护性酶可有效地清除这些有害物质。本试验发现，种子的POD、SOD活性及MDA含量均远远高于幼苗。一方面可能是由于EMS的作用在种子发育成幼苗的过程中逐渐被机体代谢掉，导致其对幼苗的影响远远不及种子；另一方面，幼苗较种子单位质量内含有更多的蛋白质和糖等物质，质量基数较大。Smith和Berjak（1995）认为，种子生命力的丧失与自由基的伤害有关，陈种子在保存过程中必然会产生并积累一定量的自由基，自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物即为MDA。本试验中，相同浓度EMS处理，99-2无论是种子还是幼苗的MDA含量均高于津育80，发芽势、发芽率及成活率均低于津育80，褐化情况也更为严重。此外，99-2种子的SOD、POD活性基本上高于津育80，可能就是由于机体为应对高浓度自由基等有害物质，需要产生更多的保护酶并表现出更高的活性所致。

高秀华，孔祥强，赵彦修，张慧．2006．盐芥EMS突变体创制的探讨．安徽农业科学，34（20）：5189-5190，5193．

和江明，王敬乔，陈薇，李根泽，寸守铣．2004．EMS对甘蓝型油菜离体小孢子胚胎发生能力的影响．西南农业学报，17（6）：690-693．

李合生．1999．植物生理生化实验原理与技术．北京：高等教育出版社：67-69．

毛培胜，常淑娟，王玉红，廉佳杰．2008．人工老化处理对羊草种子膜透性的影响．草业学报，17（6）：66-70．

王长里，付晶，杨学举．2008．EMS诱导小麦突变体的研究及展望．安徽农业科学，36（19）：8038-8039．

王幼平，徐晓霞，高宏波，蓝乐夫．1999．EMS和60Co对海甘蓝种子萌发及其M1代农艺性状的影响．木本植物研究，19（1）：64-67．

原小燕，李加纳，刘列钊．2010．EMS对油菜种子萌发的影响．西南师范大学学报：自然科学版，35（3）：217-221．

张志良．2000．植物生理学实验指导．北京：高等教育出版社：123-124．

赵世杰，许长成，邹琦，孟庆伟．1991．植物组织中丙二醛测定方法的改进．植物生理学通讯，30（3）：207-210．

Feiz L，Beecher B S，Martin J M，Giroux M J．2009a．In planta mutagenesis determines the functional regions of the wheat puroindoline proteins．Genetics，183（3）：853-860．

Feiz L，Martin J M，Giroux M J．2009b．Creation and functional analysis of new puroindoline alleles in Triticum aestivum．Theoretical and Applied Genetics，118（2）：247-257．

Ferrie A M R，Taylor D C，Mackenzie S L，Rakow G，Raney W A．2008．Microspore mutagenesis of Brassica species for fatty acid modifications：a preliminary evaluation．Plant Breeding，127：501-506．

Slade A J，Fuerstenberg S I，Loeffler D，Steine M N，Facciotti D．2005．A reverse genetic，nontransgenic approach to wheat crop improvement by TILLING．Nature Biotechnology，23（1）：75-81．

Smith M T，Berjak P．1995．Deteriorative changes associated with the loss of viability of stored desiccation tolerant and sensitive seeds// Kigel J，Galili G．Seed Development and Germination．New York：Marcel Dekker Inc：701-704．

Stephenson P，Baker D，Girin T，Perez A，Amoah S，King G J，Østergaard L．2012．A rich TILLING resource for studying gene function in Brassica rapa．BMC Plant Biology，10：62．

Wang N，Wang Y J，Tian F，King G J，Zhang C Y，Long Y，Shi L，Meng J J．2008．A functional genomics resource for Brassica napus：development of an EMS mutagenized population and discovery of FAE1 point mutations by TILLING．New Phytologist，180（4）：751-765．

Abstract：Taking Chinese cabbage‘Jinyu 80’and‘99-2’as experimental material，studied the effect of different EMS concentration treatments on seed germination，seedling growth，and major biochemical indexes of both seed and seedling．The results showed that within the scope of 0-1.0% concentration，the germination potential and germination rate of Chinese cabbage seeds were decreased，the seedling root tip and cotyledon edge gradually turned to brown．The seedling surviving rate was decreased gradually，and the conductivity value of seed leachate and MDA contents in seed and seedling were all increased gradually．The EMS effect on SOD and POD activities of seed and seedling were expressed as low concentration with promotion，and high concentration with inhibiton．The optimal EMS concentration for Chinese cabbage seed treatment was ranged from 0.4%-0.6%．

Effects of EMS Treatment on Germination and Biochemical Characteristics of Chinese Cabbage Seed

LU Yin，LIU Meng-yang，WANG Yan-hua，LUO Shuang-xia，XUAN Shu-xin，ZHAO Jian-jun，SHEN Shu-xing*

（College of Horticulture，Hebei Agricultural University，Baoding 071001，Heibei，China）

Chinese cabbage；EMS；Germination rate；SOD；POD；MDA

卢银，女，博士研究生，讲师，专业方向：蔬菜遗传育种，E-mail：luagzoujidong@163.com

*通讯作者（Corresponding author）：申书兴，男，教授，博士生导师，专业方向：蔬菜遗传育种，E-mail：shensx@hebau.edu.cn

2014-01-16；接受日期：2014-02-25

“十二五”农村领域国家科技计划项目（2012AA100202-5），农业科研杰出人才培养计划项目