野生贵州地宝兰无菌播种及根状茎繁育技术研究

蓝玉甜，韦新莲，黄 岚，罗玉婷，辛荣仕，张自斌

(广西雅长兰科植物国家级自然保护区管理局，广西乐业 533209)

贵州地宝兰[Geodorumdensiflorum(Lam.)Schltr]是广西乐业县雅长兰科国家级自然保护区的特有种植物，是一种很有开发价值的野生兰，具有观赏、药用等多种用途，于2004年贵州宝兰在广西雅长兰科保护区被发现，轰动了植物学界，因为这一物种在人们的视野中已经“消失”了80多年[1]。

贵州地宝兰首次被发现并命名是在1921年被德国植物分类学家Schletchter根据在贵州罗甸采集地唯一的一份标本命名及描述后，人们就没有在野外发现过该种，以至于我国分类学家在编写中国植物志时，只能参考德国植物分类学家的描述来记载[2]。贵州地宝兰在广西出现，无疑具有重要的科研价值，贵州地宝兰花大且花瓣呈玫瑰红色，《中国植物志》(2006年版)记载：“这在国产种类中是独一无二的”。因此，贵州地宝兰在花卉园艺产业中价值不可估量。该物种现在存数有限，濒临灭绝，是极度濒危物种。笔者主要研究贵州地宝兰人工繁育方法，旨在为贵州地宝兰的以后的人工大量繁育及野外种群恢复提供可靠的繁育技术和种苗。

1 材料与方法

1.1材料利用广西雅长兰科自然保护区野外贵州地宝兰(图1)种群在花期进行人工授粉，从授粉之日起4～5个月后，蒴果成熟，取下蒴果作为外植体进行无菌播种培养。

图1 贵州地宝兰野外生长情况

1.2方法

1.2.1材料表面消毒。取近成熟但未开裂的蒴果，先用自来水冲洗果表面3～5 min；然后用浓度75%的酒精棉球擦拭蒴果表面；接着用浓度0.1 mol/L的KOH溶液浸泡，不断摇荡，15～20 min后，再用无菌水冲洗5次，每次3～5 min，最后用无菌滤纸吸干蒴果表面水分，放置备用[3]。

1.2.2无菌播种及培养条件。蒴果消毒好之后，在超净工作台沿果中缝线纵向切开，利用无菌镊子夹起蒴果均匀的将种子撒播到每瓶培养基表面上，培养条件为前15 d弱光培养，后期光照强度在1 500～2 000 lx，每天光照10～12 h，培养温度为(25±2)℃。

1.2.3种子无菌萌发培养基的制备。1.0 g/L Hyponex1和1.0 g/L Hyponex2+1.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L ZT +100.0 mg/L CM+20 g/L蔗糖+1.0 g/L AC+5.5 g/L琼脂，pH 5.4，种子萌发率可达80%。

1.2.4原球茎增殖培养基的制备。采用MS、1/2MS、N6和B5为基本培养基，分2组添加不同激素，第1组附加0.5 mg/L NAA；第2组添加0.5 mg/L NAA和0.5 mg/L 6-BA；将大小一致、重量相等的根状茎，分别转接到处理编号分别为(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)和(8)培养基中(表1)，研究不同培养基成分和不同激素对贵州地宝兰原球茎增殖的影响，每个培养瓶接种20颗原球茎，重复10次，培养条件为光照(2 000～2 500)lx，光照12 h，培养温度(25±2)℃[4-5]。

表1 原球茎增殖培养基组成

注：1/2MS主要是大量元素减半，其他不变，所用到的香蕉汁都采用熟香蕉捣碎后所得汁液。马铃薯采用水煮后所过滤得的汁液。

1.2.5根状茎诱导芽分化培养。采用MS、1/2MS、N6和B5为基本培养基，分2组添加不同激素，第1组附加2 mg/L NAA和0.5 mg/L 6-BA激素；第2组添加0.5 mg/L NAA和1.0 mg/L 6-BA激素，将大小一致的根状茎，分别转接到处理编号为(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)和(16)培养基中(表2)，研究不同培养基成分对贵州地宝兰根状茎诱导芽分化的影响，每个培养瓶接种10个根状茎，重复10次，培养条件为光照(2 000～2 500)lx，光照12 h，培养温度(25±2)℃[6]。

表2 根状茎诱导芽分化培养基组成

1.2.6生根壮苗培养基的制备。原球茎分化成苗后，分别转到以B5为基本培养基，添加IAA不同激素浓度，主要是研究不同浓度IAA对苗生根壮苗的影响。所以选取状态一致的小苗接种到处理编号为(17)、(18)、(19)和(20)4种生根培养基中(表3)，每个培养瓶接15株小苗，重复10次，培养60 d后统计生根率及生长结果，培养条件为光照3 000 lx，光照12 h，培养温度(27±2)℃。

2 结果与分析

2.1种子无菌播种快繁种子无菌播种后，先进行30 d弱光培养，待种子萌发成白色原球茎后，采用1 500～2 000 lx的光照强度再培养40 d，发现原球茎变绿，生长健壮，这时要及时转接到增殖培养基，因在旧的培养基中培养时间过长，培养基酸化，养分减少，对后期的苗增殖、分化、生长都有一定的影响，所以要及时转接才能获得健壮的小苗。

表3 生根壮苗培养基组成

2.2不同培养基对原球苗增殖效果为寻找最适合贵州地宝兰原球茎增殖培养基，利用种子在播种培养基上培养70 d后的原球茎转入增殖培养基中，将这些原球茎转到不同成分的培养基上，附加相同浓度的0.5 mg/L NAA或0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA的激素，转接15 d左右，原球茎表面不同程度的出现细小的白色绒毛，原球茎都有不同程度的膨大，增殖过程中有的原球茎成团状，有的成根状茎，转入增殖培养基培养50 d后，观察统计8组培养基对原球茎增殖发育情况。

由表4可知，在试验的8种培养基中，原球茎都有不同程度的增殖。原球状茎的增殖倍数进行统计分析结果表明，培养50 d后，在8组培养基上的增殖倍数都有差异，但1号与5号培养基的差异显著(P<0.05)，且原球茎的增殖情况有很大的差别，这与生长调节剂和添加附加物的种类有关，培养基只加0.5 mg/L NAA和加马玲薯100.0 g/L后，增殖倍数达0.150；当培养基里多添加激素0.5 mg/L BA，附加物改为香蕉100.0 g/L后，原球茎增殖倍数反而有所下降，6、7和8号培养基的结果与其相同。因此，确定最利于贵州地宝兰原球状茎增殖培养基为：B5+0.5 mg/L NAA +100.0 g/L马铃薯+30.0 g/L蔗糖+5.8 g/L琼脂，pH 5.4(图2)。

表4 不同培养基对原球茎增殖试验结果

图2 贵州地宝兰根状茎

2.3根状茎分化成芽试验结果将在光照条件下培养60 d生长健壮的根状茎转入分化培养基进行培养，60 d后统计其分化芽数，观察不同培养基及不同激素对根状茎分化出芽率，筛选出最适合贵州地宝兰根状茎分化芽的培养基(图3)。由表5可知，MS、1/2MS、B5和N6的培养基都能诱导根状茎成芽，但添加不同激素后，成芽率各有不同。统计分析结果表明，培养60 d的根状茎在9到12号培养基中芽的诱导率差不多，在13～15号培养中也相差不大，但15号培养基中芽的诱导率最高且苗粗壮，即B5为基本培养基，添加0.5 mg/L NAA+1.0 g/L 6-BA时芽的诱导率可达(100%)，且芽长得粗壮。当NAA浓度升高而6-BA降低时，芽的长势却越来越差。根状茎在4种基本培养基中分化芽都是差不多的，但添加激素浓度不同，芽的长势也有所差异。因此，确定最适合根状茎分化成芽的培养基为：B5+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+100.0 g/L香蕉汁+25.0 g/L蔗糖+1.0 g/L AC，pH 5.4～5.5。

表5 根状茎分化成芽试验结果

图3 贵州地宝兰的增殖苗

2.4生根壮苗结果当芽长到6～7 cm时，从芽的根部切割转入以B5为基本培养基的生根壮苗培养基中，60 d后统计生根数据。由表6可知，17号培养基的生根率最高，苗也长得最高。当添加1.0 mg/L NAA时，生根率可达93.3%，而且苗高粗壮，根系发达(图4)。而20号培养基生根率最低，当添加4.0 mg/L NAA时，根少，较细小，生根率低。结果表明，随着添加NAA的浓度逐渐升高，生根率反而降低。因此，最适合无菌苗生根培养基的配方是：B5+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+100.0 g/L香蕉汁+25.0 g/L蔗糖+1.5 g/L AC，pH 5.3～5.5。

表6 生根壮苗试验结果

图4 贵州地宝兰生根苗

3 结论与讨论

(1)贵州地宝兰种子在野外比较难获得，在大自然中自然授粉比较困难，大部分都是要经过人工授粉才能获得种子，所以取材料时要选好时间，在果荚近成熟时要及时采收和播种，不要等全成熟后才釆收，播种时果荚容易开裂，而且播种时要撒播均匀，这样生长出的原球茎才比较均匀、健壮。

(2)贵州地宝兰小苗在培养基上生长时，出现褐化比较严重，特别培养超过70 d后，培养基褐变特别多，而且小苗的叶尖变黄。在试验播种阶段，播种后先采用暗光培养15 d后才转入有光培养，而且原球茎增殖到一定程度时，要及时的将原球茎转接到新的培养基上，这样可以控制和减少褐变出现；而且，试验中添加吸附剂活性碳。不管是播种还是增殖、分化、生根等，培养基里都使用活性碳，活性碳对防止褐变有明显的效果，活性碳能够吸附各阶段苗生长过程中释放出的醌类物的伤害。

(3)生长调节剂和附加物的使用：生长调节剂使用及浓度控制起着十分关键的作用，能决定种子是否萌发，原球茎增殖、分化成芽，生根等。一般都采用生长素NAA、细胞分裂素6-BA、ZT，但各阶段不用，添加的浓度也要有所差异，在播种阶段，采用1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L ZT，在原球茎增殖阶段采用0.5 mg/L NAA，分化阶段采用0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，生根阶段1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA。附加

物是一些天然提取物，包括有香蕉、土豆、椰汁等，所含的成分不同，但主要有效成分为氨基酸、植物激素等，对培养物器官组织或细胞有一定的促进生长作用。试验在原球茎增殖中作了2组试验，1组加香蕉，1组加土豆，添加土豆的增殖率比较好，香蕉就比较差，但在生根阶段又采用了香蕉提取物，根系发达，苗粗壮；说明香蕉提取物对贵州地宝兰在增殖有抑制作用，但对生根壮苗确非常有利。

[1] 冯昌林，蔡树威，邓振海.雅长林区贵州地宝兰的濒危原因及保护对策[J].广西林业，2012(9)：43-44.

[2] 陈心启，吉占和，朗楷永.中国植物志[M]．北京：科学出版社，1976：190.

[3] 胡琦敏，王任翔，黄云峰.地宝兰的离体快速繁殖[J].植物生理学通讯，2007，43(2)：309-310.

[4] 胡琦敏.地宝兰无菌播种快繁技术及原球茎的形态研究[D].桂林：广西师范大学，2007.

[5] 程麦风.大花惠兰的组织培养和快速繁殖技术研究[J].农业科技通讯，2004(3)：24-25.

[6] 马杰，何蔚红，崔波.蝴蝶兰原球茎的诱导增殖[J].河南科学，2005，23(1)：51-53.