响应面法优化白扁豆多糖的提取条件

于 鑫， 徐 敏

(1.惠州市农业科学研究所，广东惠州 516003；2.惠州市林业科学研究所，广东惠州 516003)

中药材白扁豆来源于豆科(Leguminosae)植物扁豆(DolichoslablabL.)的干燥成熟种子[1]，为药食兼优之物，营养丰富，含有脂肪油、蛋白质、尼克酸、氨基酸、维生素及糖类等成分，还含有微量元素及钙、磷、铁等，另含有磷脂类成分[2]。其以种子、种皮(扁豆衣)、花(扁豆花)供药用或食用。基于白扁豆的医药价值，现代人对白扁豆的研究越来越重视。近些年来，有关白扁豆的药材鉴别、化学成分、药理作用、产品开发研究的报道较多，但关于其多糖类成分提取工艺方面的研究鲜有报道。

生物总多糖类化合物是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分。此外，多糖化合物还广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中，是由醛基和酮基通过苷键连接的高分子聚合物，也是构成生命的4大基本物质之一。总多糖具有免疫调节、抗病毒及抗癌、降血糖、治疗肝肾疾病及消炎镇痛、美容和乳化等作用[3]。笔者采用响应面分析法对白扁豆中的总多糖提取工艺进行探讨，优选白扁豆总多糖的最佳提取工艺，以期为更好地利用白扁豆奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象。白扁豆，产地为安徽亳州，打成粉末备用。

1.1.2主要仪器。AUY-120万分之一电子天平，购自日本岛津公司；UV1102紫外分光光度计，购自上海山美公司；TDL80-2B台式离心机，购自北京时代北利离心机厂；ZF-90型暗箱式紫外投射仪，购自郑州南北仪器设备有限公司；KQ-500DB型数控超声波清洗器，苏州江东精密仪器有限公司；HWS24型电热恒温水浴锅，上海百典仪器设备有限公司。

1.1.3主要试剂。所用试剂均为国产分析纯，市售。

1.2方法

1.2.1白扁豆多糖的提取。准确称取足够量白扁豆药材粉末，加入8倍量浓度95%乙醇，回流脱脂2次，每次2～3 h。将乙醇提取后的药渣挥干至无醇味；每次取白扁豆适量，加适量的水提取；抽滤，滤液冷却后浓缩至50～100 ml。向浓缩后的滤液加入适量的乙醇，使乙醇的最终浓度为80%，室温静置24 h；离心机离心10 min(4 000 r/min)，将沉淀用适量的水溶解，定容于容量瓶，得到一定浓度的白扁豆粗多糖溶液。

1.2.2含量测定。采用苯酚-硫酸法测定白扁豆多糖含量[3-4]

1.2.3多糖提取的单因素试验。精确称取预处理过的白扁豆若干份，每份3.000 g，置于三角瓶中，放置在超声提取仪中提取，白扁豆多糖提取试验优化条件主要包括提取时间(20、40、60、80和100 min)、料液比(1∶30、1∶40、1∶50、1∶60和1∶70，W/V，g/ml，下同)、温度(40、50、60和70 ℃)，针对这几个提取条件分别进行单因素试验，考察其对提取率的影响，选择最佳提取条件。

1.2.4BoxBehnken响应面试验优化。根据单因素试验确定的提取条件范围，采用Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，以水提时间、水提温度、料液比这3个对多糖得率影响明显的工艺参数作为自变量，以粗多糖得率为响应值，采用响应面分析法对白扁豆多糖的提取条件进行优化(表1)。

表1 BoxBehnken的中心组合因素水平设计

2 结果与分析

2.1单因素试验结果图1(A)表明，随温度的增加，粗多糖提取率呈升高趋势。在温度70 ℃时粗多糖提取得率最大，多糖往往与蛋白质结合在一起，温度过高，会影响多糖的提取率。因此，选择70 ℃为最佳提取温度。图1(B)表明，随着提取时间的延长，多糖得率有升高趋势，并且从20～80 min升高趋势较快，从80～100 min则较为缓慢，因此选择80 min为最佳提取时间。图1(C)表明，料液比为1∶60时提取率达到最大值，考虑到节约成本和后续浓缩步骤，提取溶剂用量不宜太大，故料液比以1∶60较适宜。

图1 提取温度(A)、提取时间(B)、料液比(C)对白扁豆粗多糖提取率的影响

2.2响应面法优化白扁豆多糖的提取条件采用Box-Behnken程序对所得数据进行回归分析，各因素经回归拟合后，由Box-Behnken程序计算得到回归方程为：

Y=0.75+0.11A+0.048B+0.068C-0.040AB+0.050AC+0.045BC-0.046A2+0.034B2-0.061C2

式中：Y为多糖得率；A为提取温度：B为提取时间：C为料液比。当“Prob>F”值小于0.05即表示该项指标显著(P<0.05)。分析结果表明，整体模型的“Prob>F”小于0.01，表明该2次方程模型高度显著。回归方程各项的方差分析结果表明，方程的1次项、2次项的影响都是显著的(P<0.05)，并且交互项CB、AC、与AB项也显著(P<0.05)。因此，各试验因子对相应值的影响不是简单的线性关系。该模型的R2=0.984 2，RadjR2=0.963 8，说明该模型拟合效果较好，可以用于白扁豆多糖最佳提取工艺的理论预测。

2.3响应面及等高线根据拟合函数，固定一个因素“0”为水平处理，分析另外2个因素对多糖得率的影响，作出响应面和等高线图。图2～4直观的给出了各个因子交互作用响应面的3D和等值线图。比较3组图可知，温度对多糖得率的影响最为显著(P<0.05)，表现为曲面较陡；而料液比与时间次之，相应表现为曲面较为平滑，这与回归分析的结果相吻合。通过软件Design-Expert 6.0求得最佳的提取方案为：A=1；B=1；C=1，即水提温度为70 ℃，水提时间为100 min，料液比为1∶70；在此条件下，白扁豆多糖的得率最高，可到达0.96%。

表2 BoxBehnken的中心组合设计方案及试验结果

图2 提取温度和提取时间对白扁豆粗多糖提取率影响的响应面与等高线

图3 料液比和提取温度对白扁豆粗多糖提取率影响的响应面与等高线

图4 料液比和提取时间对白扁豆粗多糖提取率影响的响应面与等高线

2.4验证试验为了验证模型的实用性和准确性，以水提温度为70 ℃，水提时间为100 min，料液比为1∶70的条件进行多糖提取。3次平行试验得到的实际多糖得率为0.94%，与理论值相差0.02。因此，响应面法对白扁豆多糖提取条件的优化时可行性的，得到的提取条件具有实际应用价值。

3 结论

试验通过响应面方法得出3个因素对白扁豆中多糖得率的影响从大到小依次是:温度>料液比>时间。根据分析，确定白扁豆中总多糖的最佳提取工艺条件为:提取温度为70 ℃，提取时间100 min，料液比为 1∶70；按此条件提取出的白扁豆多糖得率比其他组和条件得到的白扁豆多糖得率要高，3次平行试验得到的实际多糖得率为0.94%，与根据方程推算最高得率相差0.02，可见此条件为白扁豆中多糖的提取的最优条件。

[1] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社，2005.

[2] 李仕海，刘训红.白扁豆及其变种的理化鉴别[J].时珍国医国药，2001,12(6)：508.

[3] LI X M,LI X L,ZHOU A G.Evaluation of Antioxidant Activity of the Polysaccharides Extracted from Lycium barbarum fruits in vitro[J].European Polymer Journal,2007,43(2):488-497.

[4] LUO Q,CAI Y Z,YAN J,et al.Hypoglycemic and Hypolipidemic Effects and Antioxidant Activity of Fruit Extracts from Lycium barbarum[J].Life Sci,2004,76:137-149.