金花茶次生代谢产物研究进展

钟春水，林玉玲，刘生财，陈裕坤，赖钟雄

（福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建福州350002）

金花茶次生代谢产物研究进展

钟春水，林玉玲，刘生财，陈裕坤，赖钟雄*

（福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建福州350002）

金花茶（Camellia nitidissima Chi）属山茶科山茶属植物[1]，曾以其稀有的金黄花色震惊了园艺界，现在其药用价值也受到越来越多的重视。据《现代本草纲目》记载，金花茶叶片具有治疗痢疾的功效，花具有治疗便血和月经过多的功效[2]。宁恩创[3]等经过动物试验发现，金花茶水提取物能够明显降低大鼠血液中脂肪含量。李翠云[4]等研究认为，金花茶可作为人肝癌的预防剂。秦小明[5]等研究发现，金花茶叶片水提取物质能够清除超氧阴离子自由基和羟基自由基。时贞颂[6]等认为，金花茶种子乙醇浸提物对肿瘤生长有抑制作用。韦锦斌[7]等通过试验发现，金花茶叶片粉末萃取物对5种人体肿瘤细胞的体外增殖有抑制作用。随着分离提取技术的发展，研究人员成功获得了金花茶的某类或者某种药用成分并对其功效进行了研究。其中关于金花茶次生代谢产物的研究因其广阔的应用前景而备受重视。为此，笔者将从生理生化、组织培养和分子生物学3个方面对金花茶主要次生代谢产物的研究现状进行分析总结，希望对金花茶次生代谢产物的开发利用有所帮助。

1 主要次生代谢产物及其作用

植物次生代谢产物是指植物体内合成的非生长必须的小分子有机物[8]。植物次生代谢产物不仅对植物自身抵抗逆境有很大的帮助，并且对人类也有很好的保健作用[9]。笔者将从含量、组成和功效3个方面阐述金花茶体内主要次生代谢产物的研究概况。

1.1 类黄酮

1.1.1 含量。唐前[10]等通过分光光度法测定了金花茶的不同部位总黄酮含量并发现，在金花茶花蕾醇提取物、叶醇提取物、叶水提取物、种子醇提取物中，总黄酮的含量分别为21.76%、0.93%、5.19%、6.85%。黄兴贤[11]等在运用分光光度法对金花茶不同发育时期的叶片进行总黄酮含量的测定后，得出以下结论：普通金花茶的新叶、1年生叶、2年生叶中总黄酮的含量分别为10.145%、3.079%、2.290%。周兴文[12]通过HPLC的方法对5个不同发育时期的金花茶花瓣中栎精-7-O-β-D-葡萄糖苷、栎精-3-O-β-D-葡萄糖苷和槲皮素这3种类黄酮物质的绝对含量进行测定和对比后发现，这3种成分的含量都呈现先上升后下降的趋势，且其最大值分别达到1 228.668 2、228.146 7和2.936 1 μg/（g鲜重）。

1.1.2 组成。陈全斌[13]等通TLC、核磁共振等方法发现，金花茶含有以槲皮素和山奈酚为苷元的类黄酮。张可锋[14]等通过高效液相色谱测定金花茶叶片黄酮苷元发现，除了槲皮素和山奈酚外还测出了另一种黄酮苷元——木犀草素。

1.1.3 功能。宁恩创[15]等通过试验发现，从显脉金花茶叶片中提取的黄酮具有显著的抗氧化作用。农彩丽[16]等通过体外试验认为，金花茶黄酮对肿瘤有抑制作用。

1.2 多酚

1.2.1 含量。唐前[17]等通过丙酮—水法从金花茶种子中提取到9.59%的总多酚。唐前[10]等利用紫外分光光度法测量了金花茶不同部位的总多酚含量发现，花蕾醇提取物、叶醇提取物、叶水提取物、种子醇提取物中总多酚的含量分别为 6.56%、3.95%、6.69%、5.88%。李仁菊[18]以GB/T 8313-2002方法对含水量为11.96%的金花茶老干叶进行了茶多酚含量的测定，结果为9.36%。

1.2.2 组成。李仁菊[18]利用高效液相色谱法在金花茶叶片中检测出了儿茶素、没食子酸、表儿茶素和绿原酸这4种小分子多酚，且其含量按上述顺序依次降低。颜栋美[19]利用高效液相色谱法检测了金花茶叶片中儿茶素、表儿茶素、儿茶酚、没食子酸和绿原酸这5种酚类物质的含量后认为，金花茶老干叶中酚类物质主要以儿茶素、没食子酸和表儿茶素为主。

1.2.3 功能。李仁菊[18]通过体外试验证实了通过微波工艺从金花茶老干叶中提取的酚类物质具有抗氧化活性；颜栋美[20]等通过体外试验发现，金花茶多酚具有和绿茶多酚相同的抗氧化能力。

1.3 皂苷

1.3.1 含量。唐前[10]等利用紫外分光光度法测定金花茶不同部位的总皂苷含量发现，花蕾醇提取物、叶醇提取物、叶水提取物、种子醇提取物中总皂苷的含量分别为21.30%、13.53%、9.91%、43.24%。

1.3.2 组成。苏琳[21]等成功地从金花茶中分离得到人参皂苷Rg1、人参皂苷F1和人参皂苷F5这3种皂苷。曾秋文[22]成功地从金花茶叶片中分离纯化得到了ISl、IS2、IS3、WS这4种皂苷组分，且从ISl中进一步分离纯化得到了结构中含有半乳糖和葡萄糖的三萜类皂苷-ISlA。

1.3.3 功能。曾秋文[22]通过体外试验发现，ISl、IS2、IS3、WS这4种皂苷组分都具有抗氧化活性，其中ISl的抗氧化活性最高。

2 组织培养与次生代谢产物开发

2.1 组织培养

据郑若仙[23]报道，其以小苗幼茎为材料成功获得了具有根、茎和叶片的无菌小苗，这是关于金花茶组织培养研究的首次报道。在后来的34年里，学者们从器官发生和体胚发生这2个途径对金花茶离体再生进行了体系建立与优化。具体研究内容如表1所示。目前，获得金花茶无菌苗的最佳途径是以金花茶成年树的幼茎为外植体诱导腋芽萌发，获得的无菌苗能以高达5.13的增殖率进行增殖[24-26]；虽然关于金花茶愈伤组织诱导的研究已有不少，但获得的愈伤组织在体胚或芽诱导方面存在困难[25，27-33]；金花茶体胚都是通过直接诱导途径获得的且其正常萌发需要成熟处理[25，29，33]。由于次生胚和愈伤组织是金花茶次生代谢产物离体生产的潜在来源，因此笔者就金花茶次生胚和愈伤组织增殖研究进行重点阐述。

2.1.1 次生胚增殖。据庄承纪[34]等报道，液体振荡培养能显著促进金花茶体胚生长与增殖，并认为产生这种现象的原因可能是液体振荡培养能够及时为新产生的体胚提供充足的营养。据翁浩[33]报道，不同光质对金花茶体胚成熟与增殖有显著影响，并指出蓝光有利于产生次生胚。林莉[25]通过比较不同浓度的2，4-D对金花茶球形胚增殖的影响发现，高浓度的2，4-D抑制金花茶体胚增殖并导致愈伤化；低浓度的2，4-D有利于球形胚发育成早期子叶胚但对体胚增殖无显著促进作用。据林莉[25]报道，添加椰子汁或者水解酪蛋白并未显著促进金花茶体胚增殖，而添加酵母浸出液抑制了金花茶次生胚的产生。也就是说，单独加入这3种有机添加物均未达到显著促进金花茶次生胚增殖的效果。林莉[25]通过试验还发现，常用的碳源中，蔗糖或山梨醇均有利于金花茶次生胚增殖，并指出同时添加这2种碳源相比于单独添加，在金花茶次生胚增殖上有更好的效果。

表1 金花茶组织培养研究现状

2.1.2 愈伤组织增殖。廖汉刃[28]等、杨旸[29]、高宇琼[30]、强风风[31]、杨舒婷[32]、Lü J[27]和翁浩[33]分别以各种金花茶外植体诱导了多样的金花茶愈伤组织，但均未对金花茶愈伤组织增殖培养进行系统研究。因此，目前关于金花茶愈伤组织增殖培养方面的研究几乎为空白。

2.2 次生代谢产物的开发

近年来涌现了不少与金花茶有关的保健品，如金花茶保健饮料[46]、金花茶保健果冻[47-48]、金花茶保健莲蓉[49]、金花茶保健蜜[50]、金花茶保健奶粉[51]、金花茶咖啡[52-53]、金花茶龟苓膏[54]、金花茶花酒[55]、金花茶奶茶[53，56]和金花茶速溶茶[57]等。

3 次生代谢相关分子生物学研究

3.1 次生代谢物质相关基因克隆

通过查阅GgenBank，目前已登录的金花茶序列总共有44条，其中cds有9条。在这9条中，与金花茶次生代谢产物相关的完整cds有7条，关于这7条完整cds的信息具体如表2所示。

3.2 次生代谢相关基因功能

3.2.1 次生代谢相关基因的表达分析。高宇琼[30]利用实时荧光定量PCR技术比较了金花茶体细胞胚胎5个不同发育阶段PPO基因表达量的差异发现，PPO基因在球形胚阶段表达量明显高于其他阶段，且其表达量随着体细胞胚的成熟基本呈下降趋势。因此，高宇琼推测PPO可能对金花茶体胚发育具有重要作用。周兴文[12]通过比较金花茶花蕾5个不同发育时期和半开期花蕾5个不同部位中CHS、CHI、F3H、F3’H、FLS和NSY这7个基因的表达情况认为，CHS可能分别与F3’H和FLS之间存在高度相关性。

3.2.2 次生代谢相关基因功能验证。周兴文[12]分别构建了FLS和NSY的正反义表达载体，并将其导入烟草中获得了相应的转基因植株。通过分析转基因烟草的色素相关成分得出以下结论：金花茶FLS的超表达能促进烟草中黄酮醇的合成；金花茶NSY的过表达能促进新黄质和紫黄质的合成。

表2 金花茶中已获得克隆且与次生代谢物质相关的基因

4 次生代谢产物研究存在的问题

4.1 液体振荡培养缺乏系统研究

庄承纪[34]等通过试验发现，相比于固体培养，液体振荡培养能显著促进金花茶体细胞生长与增殖。但除此之外并未发现其他关于金花茶体细胞胚胎液体振荡培养的研究。此外，该研究未对液体振荡培养条件下金花茶体胚与愈伤组织增殖影响因素进行研究。

4.2 离体培养物中次生代谢物质含量影响因素研究未见报道

金花茶次生代谢物质含量影响因素的研究仅仅局限于活体植株上不同部位、同一部位不同时期和同一部位同一时期不同提取方法上[10-12]；目前尚未有关离体培养过程中金花茶培养物中次生代谢物质含量影响因素研究的报道。而这方面研究的开展，将对金花茶次生代谢产物工厂化生产具有指导作用。

4.3 次生代谢相关基因的启动子研究尚未开展

众所周知，植物基因启动子对植物基因的转录具有十分重要的调控作用[61]。因此，对金花茶次生代谢相关基因的启动子研究，能够指导金花茶次生代谢产物产量的调控。但目前这方面的研究也几乎是空白。

4.4 次生代谢产物相关蛋白质组学研究仍为空白

林莉[25]对金花茶6个阶段的体胚进行了蛋白质的SDS-PAGE测定；梁机[62]等对8种金花茶进行了比较蛋白质组学分析；杨旸[29]采用双向电泳的方法比较了金花茶体细胞胚胎4个阶段总蛋白种类的差异。但目前对金花茶次生代谢物质相关蛋白质组学的研究尚未开展。

4.5 缺乏高通量测序带来的数据支持

通过查询NCBI等数据库，笔者尚未发现有金花茶的转录组或者基因组数据。这种状况导致研究人员对金花茶的遗传背景缺乏认识，且无法获得现代高通量测序带来的数据支持。因此，研究人员只能采用同源克隆法对金花茶次生代谢相关基因进行克隆。

5 展望

组织培养具有繁殖速度快、条件可控和易规模化等特点，对金花茶进行次生代谢产物离体生产具有创造巨大财富的潜力。关于金花茶次生代谢相关基因启动子的研究具有填补研究空白和指导生产的理论和现实意义，因此开展这方面的研究十分必要。此外，进行金花茶基因组学的研究能够大大促进金花茶次生代谢产物相关分子生物学研究。儿茶素是金花茶中含量较高且具有较好药用价值的酚类物质，但关于其积累影响因素的研究几乎是空白。因此，从组织培养、生理生化和分子生物学方面对其进行研究具有重要的理论和现实意义。

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（责任编辑 金苹）

Research Progress on Secondary Metabolities in Camellia nitidissima Chi.

从生理生化、组织培养与分子生物学3个方面对金花茶次生代谢产物含量、组成、功效、离体培养物生产与分子生物学的研究现状及存在问题进行概述，并展望了金花茶次生代谢产物今后的研究方向。

金花茶；次生代谢产物；生理生化；组织培养；分子生物学；研究进展

ZHONG Chun-shuiet al.(Institute of Horticultural Biotechnology,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002)

Research status and existing problems about content,composition,function,in vitro production and molecular biology of secondary metabolities in Camellia nitidissima Chi were summarized from physiological and biochemical,tissue culture and molecular biology.And the research orientation in the future was proposed.

Camellia nitidissima Chi;Secondary metabolities;Physiology and biochemistry;Tissue culture; Molecular biology;Research progress

S685.14

A

2095-0896（2014）07-058-05

福建省农业科技平台项目（2008N2001）。

钟春水（1990-），男，福建长汀人，硕士研究生，研究方向：花卉生物技术，E-mail：291768260@qq.com。*通讯作者，博士，研究员，博士生导师，从事园艺植物生物技术与遗传资源研究，E-mail：laizx01@163.com。

2014-06-21