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DR5上调在5—烯丙基—7—二氟甲氧基白杨素增强TRAIL诱导人肺癌A549细胞凋亡中的作用

2014-03-13谢朝晖等

关键词:白杨选择性毒性

谢朝晖等

摘要 目的:观察5烯丙基7二氟甲氧基白杨素(AFMC) )是否协同肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导人肺腺癌A549细胞凋亡.并探讨其机制是否涉及死亡受体5(DR5)的上调.方法:体外培养人肺腺癌A549细胞和人胚肺WI38细胞.碘化丙啶(PI)染色流式细胞术(FCM)定量分析细胞凋亡率;DNA琼脂糖凝胶电泳观察细胞DNA梯形条带;Western Blotting 检测DR5蛋白表达.结果:单独用亚毒性浓度的AFMC(1.0 μmol/L) 或TRAIL(30 μg/L)处理A549细胞,细胞凋亡率不超过5%.AFMC(1.0 μmol/L)联合TRAIL(30 μg/L)的A549细胞凋亡率增高(37.80%, P<0.01);而WI38细胞仅有极少量的细胞凋亡(P>0.05).DNA琼脂糖凝胶电泳显示:两者合用A549细胞呈现典型的DNA梯形条带图谱,而WI38细胞未出现DNA梯形条带;Western Blotting分析发现:AFMC呈浓度和时间依赖性上调A549细胞DR5的表达,DR5特异性抑制剂DR5/Fc嵌合蛋白能有效降低两者合用诱导的A549 细胞凋亡率(P<0.05).然而,AFMC对WI38细胞DR5表达无明显影响.结论:亚毒性浓度的AFMC选择性增强TRAIL诱导人肺癌A549细胞凋亡.其机制可能与其上调 DR5表达有关.

关键词 肺癌;5烯丙基7二氟甲氧基白杨素;肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体;死亡受体5;细胞凋亡

中图分类号 R966 文献标识码 A 文章编号1000-2537(2014)01-0022-06

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNFrelated apoptosisinducing ligand,TRAIL) 及其受体(“死亡”受体:DR4和DR5)属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员,它具有选择性诱导多种肿瘤细胞及转化细胞凋亡,而对正常细胞没有明显细胞毒性的生物学特点,成为了一种极具发展潜力和应用前景的肿瘤靶向治疗因子.但有研究证实,超过50%的肿瘤细胞对TRAIL不敏感[1].庆幸的是,越来越多的实验结果表明TRAIL 与化疗或放疗药物联合治疗能克服大多数肿瘤细胞对TRAIL 的耐受并获得协同杀伤效应[2].

白杨素(5,7二羟基黄酮,ChR)是从多种植物、蜂胶和蜂蜜中提取的一种具有广泛生物活性的天然食源性黄酮.有研究报道指出:白杨素对非小细胞肺癌、恶性胶质瘤、子宫颈癌、白血病、食道鳞癌等多种肿瘤细胞具有良好的抗增殖活性和凋亡诱导作用,而对正常细胞未见明显毒性[3].但由于其肠道吸收甚少且5,7位羟基易被迅速糖基化代谢,导致该化合物的生物利用度降低,体内活性较低,因此,其应用受到限制[4].为此,作者以ChR为先导化合物,通过化学修饰得到ChR类似物5烯丙基7二氟甲氧基白杨素(5allyl7gendifluoromethoxy chrysin,AFMC).在前期研究中,作者证明AFMC具有较ChR更强的诱导人肝癌HepG2细胞[5]、人卵巢癌CoC1细胞 [6]、人肺癌A549细胞[7]凋亡作用.

Ding等[8]证实白杨素能通过下调cFLIP,上调TRAILR2(DR5)增强TRAIL介导的白血病ATL、乳腺癌MDAMB231、结肠癌HT29、肝细胞癌HepG2、黑色素瘤细胞SKMEL37、胰腺癌Capan1等多种恶性肿瘤细胞凋亡.Jin等[9]报道白杨素类似物柚皮素通过上调DR5增强非小细胞肺癌A549细胞TRAIL耐药株对TRAIL的敏感性.本文研究亚细胞毒浓度的AFMC是否通过上调DR5表达,增强TRAIL诱导的A549细胞凋亡.

1材料和方法

1.1试剂

5烯丙基7二氟甲氧基白杨素(AFMC)按照文献[10]方法合成,分子式:C19O4H14F2;相对分子质量:344,性状:淡黄色晶体;纯度:99.0%.白杨素(ChR)和碘化丙啶(PI)为Sigma公司产品;重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)由PeproTech公司生产;DNA Ladder检测试剂盒购于北京博大泰克公司;重组人DR5/Fc嵌合蛋白购自R&D Systems (Minneapolis,MN).

1.2细胞培养

人肺癌A549细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(中国武汉);人胚肺WI38细胞购自中国科学院细胞库(中国上海).在37 ℃、5% CO2(体积分数,下同)及饱合湿度条件下,用含10%小牛血清,1667 mkat/L(即105 U/L)青霉素及1667 mkat/L链霉素的RPMI1640完全培养基传代培养,选取对数生长期细胞用于各项实验.

1.3流式细胞术分析

取对数生长期细胞用含10%小牛血清的培养基处理24 h进行细胞周期同步化后,分别加入含AFMC (1.0 μmol/L)、TRAIL(30 μg/L)以及两者合用的完全培养基孵育24 h;0.2% DMSO作为溶媒对照.收集细胞,加入PBS制备单细胞悬浮液, 再用冷却的PBS冲洗2次, 用70%酒精4 ℃ 固定24 h, PI染色后用流式细胞仪(American BD Company, FACS420)检测细胞凋亡.

1.4DNA琼脂糖凝胶电泳

收集各组细胞,PBS洗涤2次,按照DNA Ladder Detection Kit说明书操作,提取细胞DNA, 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段.

1.5Western Blotting分析

收集不同处理组细胞,PBS洗涤3次,用细胞裂解液(0.1 mol/L NaCl, 0.01 mol/L Triscl(pH 7.6), 0001 mol/L EDTA(pH 8.0), 1 mg/L Aprotinin, 100 mg/L PMSF)裂解细胞后提取细胞总蛋白.每组取25 μg蛋白样品进行10% SDSPAGE电泳(100 mA, 3 h),转移至PVDF膜上,用含5%脱脂牛奶的TBST室温下封闭2 h,然后分别加入1∶〖KG-2mm〗1 000稀释的DR5(p48)和βactin一抗,37 ℃孵育2 h;TBST缓冲液洗膜10 min×3次,加入相应的二抗室温孵育1 h后,TBST洗膜3次,每次15 min.ECL化学发光,显影,定影.实验中以βactin作为内参照蛋白.

1.6统计学分析

实验数据用SPSS 15.0软件包建立数据库(SPSS Inc, Chicago, IL),并进行统计学分析.数据表示为±s,经方差齐性检验后,用单向方差分析(One Way ANOVA)对多组均值进行比较,用LSD法对均值进行两两比较.P<0.05为差异具有统计学意义的标准.

2结果

21亚毒性浓度的AFMC、TRAIL及两者合用对人肺癌A549细胞凋亡的影响

PI染色FCM分析显示:1.0 μmol/L AFMC、30 μg/L TRAIL单用以及两者合用的A549细胞凋亡率(SubG1细胞百分率)分别为2.53%±0.35%,269%±0.52%,37.80%±1.78%.两者合用的细胞凋亡率是各自单用时细胞凋亡率之和的7.2倍(P<0.05,图1).A549细胞凋亡率在两者合用12 h后开始增加,24 h达高峰(图2).提示亚毒性浓度的AFMC能增敏TRAIL诱导人肺癌A549细胞凋亡.

22 亚毒性浓度的AFMC、TRAIL及两者合用对人肺癌A549细胞DNA断裂的影响

DNA琼脂糖凝胶电泳显示: 1.0 μmol/L AFMC或30 μg/L TRAIL分别作用于人肺癌A549细胞24 h,未见凋亡特异性的DNA梯形条带,而1.0 μmol/L AFMC预孵育30 min后,再加入30 μg/L TRAIL处理24 h,展现典型DNA梯形条带图谱(图3A).进一步证实:亚毒性浓度的AFMC具有增强TRAIL诱导人肺癌A549细胞凋亡作用.

23AFMC对人肺癌A549细胞DR5蛋白表达的影响

Western Blotting分析表明:AFMC以浓度和时间依赖方式上调A549细胞DR5蛋白表达,DR5表达在AFMC作用6 h后开始增加,先于AFMC和TRAIL两者合用12 h后引起的细胞凋亡率增加(图4A,图5).

24DR5拮抗性抗体对AFMC增强TRAIL诱导人肺癌A549细胞凋亡作用影响

DR5拮抗性抗体DR5/Fc嵌合蛋白能使亚毒性浓度AFMC和TRAIL合用的A549细胞凋亡率从37.80%±1.78%下降至7.61%± 0.32%( P<0.05,图6),表明AFMC上调DR5表达是其增敏作用的机制之一.

25AFMC、TRAIL及两者合用对人胚肺WI38细胞的影响

1.0 μmol/L AFMC、30 μg/L TRAIL分别单用或两者联合处理人胚肺WI38细胞,其细胞凋亡率与溶媒组比较,差异均无统计学意义(P>0.05,图1).AFMC、TRAIL无论单用或合用于WI38细胞24 h,均未呈现凋亡特异性的DNA梯形条带(图3B).AFMC对WI38细胞DR5表达无明显影响(图4B).说明:亚毒性浓度的AFMC 对TRAIL诱导凋亡的增敏作用具有肺癌细胞选择性,与其选择性上调肺癌细胞DR5 表达有关.

3讨论

肺癌系全世界最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年约有100~130万患者死于肺癌.我国卫生部2008年4月29日公布的第三次全国居民死亡原因调查显示,过去30年间我国肺癌死亡率上升了465%,肺癌已位居我国恶性肿瘤死亡率之首.其中约80%的肺癌患者为非小细胞肺癌(NSCLC),NSCLC发病隐匿,早期不易诊断,确诊时多为中、晚期,已丧失手术良机.目前治疗NSCLC的药物因其非选择性杀伤作用和较强的毒副反应,临床应用受限.临床仍采取以化疗为主的综合治疗,但5年生存率仍低于15%,并且极易复发、转移[11].寻求高效、低毒的新型抗肺癌药物是当前肿瘤防治研究的热点.

TRAIL是1995年发现的与FasL和TNFα有较高同源性的TNF超家族成员.它们都能与靶细胞膜上特异性DR4和DR5受体结合,通过多种死亡信号转导途径诱导靶细胞凋亡.与TNF、FASL不同,TRAIL能选择性诱导肿瘤细胞、转化细胞、病毒感染细胞凋亡,而对肝细胞、骨髓细胞等正常细胞几乎无毒性.大量临床前实验证实TRAIL能有效地诱导多种肿瘤细胞系凋亡 [12].然而随着研究的深入,越来越多的肿瘤细胞尤其是一些恶性肿瘤对TRAIL存在先天性或获得性耐受[2].如何有效逆转肿瘤细胞对TRAIL的凋亡抵抗是当前亟待解决的问题.研究表明,细胞表面DR4和DR5的表达水平是决定肿瘤细胞对TRAIL敏感性的关键,而且在正常37 ℃的生理条件下, TRAIL与其受体结合,DR5的亲和力最强,从而在TRAIL诱导的凋亡通路中发挥最大作用[13].如何上调DR尤其是DR5的表达,增强肿瘤细胞的TRAIL敏感性,充分发挥TRAIL的选择性杀伤效应成为近年研究的热点.

作者前期研究通过细胞毒实验确定了AFMC和TRAIL的亚毒性(细胞毒性<15%)浓度,证实人肺癌A549细胞对TRAIL耐药且AFMC能选择性增强TRAIL对A549细胞毒作用[14].那么,这种细胞毒增敏效应是否通过诱导细胞凋亡实现?本文通过FCM分析和琼脂糖凝胶电泳证明,亚毒性浓度的AFMC与TRAIL联用能协同诱导A549细胞凋亡.文献报道[8],白杨素能通过上调DR5表达增强TRAIL对多种恶性肿瘤的凋亡诱导作用.前期研究中,作者发现不同浓度AFMC对A549细胞DR4的表达未见明显影响.Western Blotting检测AFMC呈浓度和时间依赖方式上调DR5表达.DR5拮抗性抗体DR5/Fc嵌合蛋白能使AFMC和TRAIL合用的A549细胞凋亡率显著下降.提示DR5的表达上调是AFMC增敏TRAIL诱导A549细胞凋亡的机制之一.前期研究表明AFMC和TRAIL合用对永生化二倍体人胚肺WI38细胞无明显细胞毒性,本文同样证实了两者合用对WI38细胞无明显凋亡诱导作用,且AFMC对WI38细胞DR5表达无影响.综合以上结果作者推测:AFMC选择性增敏TRAIL 诱导人肺癌A549细胞凋亡,与其上调DR5 表达有关.关于AFMC如何上调DR5的具体机制仍有待深入研究和探讨.本文结果可为将天然食源性黄酮化学改造,开发基于TRAIL抗肿瘤治疗提供新途径.

参考文献:

[1]GANTEN T M, HAAS T L, SYKORA J, et al. Enhanced caspase8 recruitment to and activation at the DISC is critical for sensitisation of human hepatocellular carcinoma cells to TRAILinduced apoptosis by chemotherapeutic drugs[J]. Cell Death Differ, 2004,11 (Suppl 1):8696.

[2]SINGH T R, SHANKAR S, CHEN X, et al. Synergistic interactions of chemotherapeutic drugs and tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand on apoptosis and on regression of breast carcinoma in vivo[J].Cancer Res, 2003,63(17):53905400.

[3]KHOO B Y, CHUA S L, BALARAM P. Apoptotic effects of chrysin in human cancer cell lines[J]. Int J Mol Sci, 2010,11(5):21882199.

[4]HADJERI M, BARBIER M, RONOT X, et al. Modulation of Pglycopretein mediated multidrug resistance by flavonoid derivatives and analogues[J]. Med Chem, 2003,46(11):21252131.

[5]TAN X W, XIA H, XU J H, et al. Induction of apoptosis in human liver carcinoma HepG2 cell line by 5allyl7gendifluoromethylenechrysin[J].World J Gastroenterol, 2009,15(18):22342239.

[6]LI J L, XIE W Y, CAO J G. The effect of 5allyl7gendifluoromethylenechrysin on proliferation and apoptosis in ovarian cancer cell cultured in vitro[J]. Am J Chin Clin Med, 2005,7:323326.

[7]许金华,谭翔文,曹建国.ADFMChR对人肺癌A549细胞增殖活性的影响[J]. 南华大学学报:医学版, 2009,37(6):673676.

[8]DING J, POLIER G, KHLER R, et al . Wogonin and related natural flavones overcome tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand (TRAIL) protein resistance of tumors by downregulation of cFLIP protein and upregulation of TRAIL receptor 2 expression[J].J Biol Chem, 2012,287(1):641649.

[9]JIN C Y, PARK C, HWANG H J, et al. Naringenin upregulates the expression of death receptor 5 and enhances TRAILinduced apoptosis in human lung cancer A549 cells[J].Mol Nutr Food Res, 2011,55(2):300309.

[10]ZHENG X, CAO J G, LIAO D F, et al. Systhesis and anticancer effect of gemdifluoromethylenated chrysin derivatives[J].Chin Chem Lett, 2006,17(11):14391442.

[11]WALKER S. Updates in nonsmall cell lung cancer[J].Clin J Oncol Nurs, 2008,12(4):587596.

[12]ZHANG T, WU M, CHEN Q, et al. Investigation into the regulation mechanisms of TRAIL apoptosis pathway by mathematical modeling [J].Acta Biochim Biophys Sin, 2010,42(2):98108.

[13]TRUNEH A, SHARMA S, SILVEMAN C, et al.Temperaturesensitive differential affinity of TRAIL for its receptors DR5 is the highest affinity receptor[J].J Biol Chem, 2000,275(30):2331923325.

[14]谢朝晖,刘飞,曹建国,等. AFMC选择性增强TRAIL对肺癌A549细胞毒性[J].湖南师范大学学报:医学版, 2011,8(1):2023.

(编辑王健)

参考文献:

[1]GANTEN T M, HAAS T L, SYKORA J, et al. Enhanced caspase8 recruitment to and activation at the DISC is critical for sensitisation of human hepatocellular carcinoma cells to TRAILinduced apoptosis by chemotherapeutic drugs[J]. Cell Death Differ, 2004,11 (Suppl 1):8696.

[2]SINGH T R, SHANKAR S, CHEN X, et al. Synergistic interactions of chemotherapeutic drugs and tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand on apoptosis and on regression of breast carcinoma in vivo[J].Cancer Res, 2003,63(17):53905400.

[3]KHOO B Y, CHUA S L, BALARAM P. Apoptotic effects of chrysin in human cancer cell lines[J]. Int J Mol Sci, 2010,11(5):21882199.

[4]HADJERI M, BARBIER M, RONOT X, et al. Modulation of Pglycopretein mediated multidrug resistance by flavonoid derivatives and analogues[J]. Med Chem, 2003,46(11):21252131.

[5]TAN X W, XIA H, XU J H, et al. Induction of apoptosis in human liver carcinoma HepG2 cell line by 5allyl7gendifluoromethylenechrysin[J].World J Gastroenterol, 2009,15(18):22342239.

[6]LI J L, XIE W Y, CAO J G. The effect of 5allyl7gendifluoromethylenechrysin on proliferation and apoptosis in ovarian cancer cell cultured in vitro[J]. Am J Chin Clin Med, 2005,7:323326.

[7]许金华,谭翔文,曹建国.ADFMChR对人肺癌A549细胞增殖活性的影响[J]. 南华大学学报:医学版, 2009,37(6):673676.

[8]DING J, POLIER G, KHLER R, et al . Wogonin and related natural flavones overcome tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand (TRAIL) protein resistance of tumors by downregulation of cFLIP protein and upregulation of TRAIL receptor 2 expression[J].J Biol Chem, 2012,287(1):641649.

[9]JIN C Y, PARK C, HWANG H J, et al. Naringenin upregulates the expression of death receptor 5 and enhances TRAILinduced apoptosis in human lung cancer A549 cells[J].Mol Nutr Food Res, 2011,55(2):300309.

[10]ZHENG X, CAO J G, LIAO D F, et al. Systhesis and anticancer effect of gemdifluoromethylenated chrysin derivatives[J].Chin Chem Lett, 2006,17(11):14391442.

[11]WALKER S. Updates in nonsmall cell lung cancer[J].Clin J Oncol Nurs, 2008,12(4):587596.

[12]ZHANG T, WU M, CHEN Q, et al. Investigation into the regulation mechanisms of TRAIL apoptosis pathway by mathematical modeling [J].Acta Biochim Biophys Sin, 2010,42(2):98108.

[13]TRUNEH A, SHARMA S, SILVEMAN C, et al.Temperaturesensitive differential affinity of TRAIL for its receptors DR5 is the highest affinity receptor[J].J Biol Chem, 2000,275(30):2331923325.

[14]谢朝晖,刘飞,曹建国,等. AFMC选择性增强TRAIL对肺癌A549细胞毒性[J].湖南师范大学学报:医学版, 2011,8(1):2023.

(编辑王健)

参考文献:

[1]GANTEN T M, HAAS T L, SYKORA J, et al. Enhanced caspase8 recruitment to and activation at the DISC is critical for sensitisation of human hepatocellular carcinoma cells to TRAILinduced apoptosis by chemotherapeutic drugs[J]. Cell Death Differ, 2004,11 (Suppl 1):8696.

[2]SINGH T R, SHANKAR S, CHEN X, et al. Synergistic interactions of chemotherapeutic drugs and tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand on apoptosis and on regression of breast carcinoma in vivo[J].Cancer Res, 2003,63(17):53905400.

[3]KHOO B Y, CHUA S L, BALARAM P. Apoptotic effects of chrysin in human cancer cell lines[J]. Int J Mol Sci, 2010,11(5):21882199.

[4]HADJERI M, BARBIER M, RONOT X, et al. Modulation of Pglycopretein mediated multidrug resistance by flavonoid derivatives and analogues[J]. Med Chem, 2003,46(11):21252131.

[5]TAN X W, XIA H, XU J H, et al. Induction of apoptosis in human liver carcinoma HepG2 cell line by 5allyl7gendifluoromethylenechrysin[J].World J Gastroenterol, 2009,15(18):22342239.

[6]LI J L, XIE W Y, CAO J G. The effect of 5allyl7gendifluoromethylenechrysin on proliferation and apoptosis in ovarian cancer cell cultured in vitro[J]. Am J Chin Clin Med, 2005,7:323326.

[7]许金华,谭翔文,曹建国.ADFMChR对人肺癌A549细胞增殖活性的影响[J]. 南华大学学报:医学版, 2009,37(6):673676.

[8]DING J, POLIER G, KHLER R, et al . Wogonin and related natural flavones overcome tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand (TRAIL) protein resistance of tumors by downregulation of cFLIP protein and upregulation of TRAIL receptor 2 expression[J].J Biol Chem, 2012,287(1):641649.

[9]JIN C Y, PARK C, HWANG H J, et al. Naringenin upregulates the expression of death receptor 5 and enhances TRAILinduced apoptosis in human lung cancer A549 cells[J].Mol Nutr Food Res, 2011,55(2):300309.

[10]ZHENG X, CAO J G, LIAO D F, et al. Systhesis and anticancer effect of gemdifluoromethylenated chrysin derivatives[J].Chin Chem Lett, 2006,17(11):14391442.

[11]WALKER S. Updates in nonsmall cell lung cancer[J].Clin J Oncol Nurs, 2008,12(4):587596.

[12]ZHANG T, WU M, CHEN Q, et al. Investigation into the regulation mechanisms of TRAIL apoptosis pathway by mathematical modeling [J].Acta Biochim Biophys Sin, 2010,42(2):98108.

[13]TRUNEH A, SHARMA S, SILVEMAN C, et al.Temperaturesensitive differential affinity of TRAIL for its receptors DR5 is the highest affinity receptor[J].J Biol Chem, 2000,275(30):2331923325.

[14]谢朝晖,刘飞,曹建国,等. AFMC选择性增强TRAIL对肺癌A549细胞毒性[J].湖南师范大学学报:医学版, 2011,8(1):2023.

(编辑王健)

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