大脑神经递质多巴胺检测方法研究

张庆云，李佳林，郑 培，李艳霞，车雨轩，董晓东

（河北大学基础医学院，河北 保定 071000）

大脑神经递质多巴胺检测方法研究

张庆云，李佳林，郑 培，李艳霞，车雨轩，董晓东

（河北大学基础医学院，河北 保定 071000）

多巴胺是人脑中一种特殊的神经传递介质，其含量的异常变化将导致一些临床病症的出现，例如帕金森病。因此如何简单快速地检测多巴胺成为全世界研究者们关注的课题。常用的检测方法有分光光度法、化学发光法、化学荧光法、液相色谱法和电化学方法等，现对近几年有关多巴胺检测方法的研究作一综述。

多巴胺；神经递质；帕金森病；检测

多巴胺（dopamine, DA）是一种存在于神经组织和体液中的儿茶酚胺类神经递质，是脑功能的物质基础。它在人脑中特定区域的含量分布影响着垂体内分泌机能的协调，而且直接与神经活动有关。脑内多巴胺神经功能失调是精神分裂症和帕金森氏症的重要原因。此外，多巴胺还具有兴奋心脏、增加肾血流量的功能，用于治疗缺血性、心源性及感染性休克。因此, 开展多巴胺分析方法的研究在神经生理机能、疾病诊断及相关药物的质量控制等方面有着重要意义。

1 分光光度法

陈家柏等[1]用分光光度法测定了血液中微量多巴胺的浓度。该方法采用硫酸亚铁-酒石酸盐溶液为显色剂，在520 nm处测定吸光度，结果显示在2～10 μg/mL浓度范围内，盐酸多巴胺的吸光度与浓度呈良好的线性关系。在临床中对肾功能不全患者进行血液透析时，为了防止部分患者出现低血压，通过微泵持续给予多巴胺，常用剂量下的血液中多巴胺的浓度位于此线性范围之内。这为临床血液透析中调整多巴胺输入剂量提供了理论依据。龙云等[2]利用荷移反应，采用四氯苯醌为显色剂，在480 nm处测定吸光度，用该方法测定了食品中多巴胺的含量。潘自红等[3]研究了在碱性的氨水溶液中，FeCl3与盐酸多巴胺反应生成紫红色配合物，该配合物最大吸收波长为507 nm，络合比为1∶2。体系的吸光度与盐酸多巴胺的浓度在20.0～220 mg/L呈良好的线性关系，建立了测定盐酸多巴胺的新方法，该方法能够直接用于注射液中盐酸多巴胺的测定。

2 化学发光法

化学发光方法因具有灵敏度高、仪器简单、快速等特点越来越受到人们的重视，在分析工作中得到广泛的应用。王术皓等[4]利用碱性介质中, 盐酸多巴胺对鲁米诺-铁氰化钾化学发光反应体系的强烈抑制作用, 建立了反相流动注射抑制化学发光测定盐酸多巴胺的新方法。研究了影响化学发光强度的因素, 并探讨了化学发光反应的可能机理。该方法快速、准确、线性范围宽，可用于盐酸多巴胺注射液中盐酸多巴胺的测定。牛凌梅等[5]研究发现，在硫酸环境下，高锰酸钾氧化多巴胺能形成化学发光体系，该体系的发光强度与多巴胺的浓度在1.25～25.0 mg/L呈良好的线性关系，方法的检出限为1.00 mg/L，建立了硫酸环境中流动注射化学发光法测定多巴胺的新方法。该方法可用于针剂中多巴胺的测定。进一步，该小组[6]又利用自制微透析探针收集透析液中多巴胺检测的方法，建立了微透析法取样，化学发光测定多巴胺的新方法。结果表明自制探针的回收率与透析膜长度呈正相关，与灌流速度呈反相关。外液中多巴胺的浓度在25.0～250 mg/L时，所测的发光强度与其浓度呈良好的线性关系。表明自制微透析探针性能稳定，可进行体液中多巴胺的检测。马新颜等[7]研究发现，在酸性介质中，高锰酸钾氧化甲醛能产生化学发光信号，当该体系中存在多巴胺时，体系发光信号会显著增强。基于这一现象，建立了测定多巴胺的流动注射化学发光新方法。并将该方法用于全血中多巴胺的测定。

3 化学荧光法

CdTe量子点由于其优良的荧光分析特性而作为荧光试剂应用在金属离子和生物活性物质的标记和高灵敏分析中。陈志兵等[8]在温和的条件下制备CdTe量子点，研究表明，该量子点的荧光强度可强烈地被盐酸多巴胺增敏。据此发现并建立了以CdTe量子点作为荧光探针，基于荧光增敏测定有机药物成分中盐酸多巴胺含量的新方法。颜梅等[9]制备了以二硫基琥珀酰亚胺丙酸酯，4-巯基苯硼酸功能化CdTe量子点探针，在431 nm激发波长下，对探针及加入多巴胺后进行发射光谱扫描，在最大发射波长处，多巴胺对合成的探针具有猝灭效应，且多巴胺对体系的猝灭程度与多巴胺的量呈良好的线性关系，据此建立了一种基于双分子识别荧光猝灭法高选择性测定多巴胺的新方法。在最佳条件下，多巴胺的线性范围为0.02～20.0 mmol/L，检出限为4.9 nmol/ L。该方法已成功用于多巴胺注射液、血清及尿样中多巴胺的测定。陈亚红等[10]研究发现，在碱性介质中，盐酸多巴胺对血红蛋白酶催化荧光体系具有强烈的猝灭作用, 因此建立了酶催化荧光光谱法测定盐酸多巴胺的新方法。该方法的检出限为8.2 nmol/L。该法具有操作简单、灵敏度高、选择性好的特点，已成功地应用于药物制剂中盐酸多巴胺含量的测定。

4 液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）也是通用的多巴胺检测方法。高效液相色谱法因其具有极高的分离率，所以在儿茶酚胺类物质的分析中受到极大重视。HPLC法同荧光检测相结合是目前较为有效且常用的方法。儿茶酚胺类物质本身有自然荧光，经HPLC法分离后，可以利用它的荧光进行检测。吴予明等[11]利用HPLC和荧光检测器对嗜铬细胞瘤患者和正常人24 h尿中的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺进行了测定。结果可见，多巴胺浓度在130.6～3 858.2 nmol/L与色谱峰峰高的线性关系良好。测定结果显示此法简单、准确、特异性高。通过对正常人及嗜铬细胞瘤患者24 h尿样分析，二者儿茶酚胺类物质的含量有显著性差异。表明该研究可以为临床嗜铬细胞瘤诊断提供数据。乔坤云等[12]采用与文献[11]不同的色谱柱，不同的前处理方法，用高效液相色谱法，荧光检测器检测儿茶酚胺含量。实验表明去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺三种组分的浓度与其峰面积均呈良好的线性关系。该方法可在临床推广使用。

5 电化学方法

由于多巴胺分子内含有2个容易被氧化的酚羟基，故具有电化学活性，因此可用电化学方法对其进行定量检测。然而，多巴胺在金电极、铂电极或玻碳电极等裸电极上的过电位高，电极反应缓慢，且其本身或反应产物易吸附于电极表面，导致电极钝化，灵敏度低。此外在一些生物样品中, 共存物质如肾上腺素( EP )、维生素C、尿酸（UA）其氧化峰电位与多巴胺相近, 所以对多巴胺的测定造成严重干扰。因此，如何选择性地测定多巴胺成为多巴胺检测的研究热点和难点。近年来的研究发现，化学修饰电极能降低过电位并可增加多巴胺的传质速率，并能有效地利用电极的修饰表面对分析物选择富集、渗透等功能进行检测。从而提高分析的选择性和灵敏度。故使用化学修饰电极研究多巴胺的电化学行为引起了人们的广泛关注。

牛凌梅等[13]用2,3-二巯基丁二酸修饰金电极，研究了肾上腺素和多巴胺在该修饰电极上的电化学响应，表明由于该电极的催化作用，肾上腺素和多巴胺的电化学信号明显增强。研究发现肾上腺素与多巴胺的氧化峰电位虽不可分离，但在该修饰金电极上，肾上腺素没有还原峰，故还原峰电流只与多巴胺的浓度呈线性关系，而氧化峰电流却恰好等于两者单独氧化的峰电流之和。因此，建立了一种同时测定多巴胺与肾上腺素含量的方法。陈德志等[14]利用循环伏安法电聚合研制了溴百里香酚蓝聚合膜修饰电极，研究了多巴胺在该修饰电极上的伏安行为，建立了维生素C和尿酸同时存在时多巴胶定量检测的电化学新方法，并将该法用于实际样品盐酸多巴胺注射液的含量检测。孙瑶等[15]采用循环伏安法制备了预阳极化碳糊电极，研究了对乙酰氨基酚和多巴胺在该修饰电极上的电化学行为。结果表明，预阳极化碳糊电极对对乙酰氨基酚和多巴胺的电化学行为具有良好的电催化作用。对乙酰氨基酚和多巴胺的氧化峰电流与其浓度在2.0×10-6～5.0×10-4mol/L呈良好的线性关系，检出限分别为6.3×10-7mol/L和2.5×10-7mol /L。该方法已用于药物样品中对乙酰氨基酚和多巴胺的测定。

6 其他方法

邢宪荣等[16]利用分子印迹技术，结合聚苯胺、多壁碳纳米管和金纳米粒子-丝素蛋白复合物构建新型检测多巴胺的分子印迹电化学传感器。分子印迹聚合物以多巴胺为模板，正硅酸乙酯和苯基三乙氧基硅烷为功能单体合成。当pH值为7.0，模板与单体的物质的量比为1∶5 时，该传感器的线性范围为5.0×10-8～9×10-6mol /L，检测限为1.02×10-8mol /L。

课题组[17-19]采用电化学腐蚀/沉积方法制备溶液中稳定的贵金属Au量子线，因为金属量子线的电导仅被导线最细部分的少数几个原子所决定，因此在表面吸附少数几个分子必然会带来量子线电导的改变。而多巴胺分子中含有一个自由的氨基，能与Au形成配位键，因而多巴胺分子的吸附必然会带来Au量子线电导的改变。研究表明，该方法可以高灵敏度检测多巴胺，理论上可以达到分子水平。而且不会受到维生素C和二羟基苯丙酸的干扰，因为两者分子中不含有与金成键的基团。目前该方法适用于检测简单体系中的多巴胺，如药剂检测。对于复杂体系中的检测则存在缺陷，因此需要结合其他手段提高其选择性，这是课题组目前工作的方向。

[1] 陈家柏, 肖丽英, 卢结文. 血液中微量盐酸多巴胺测定方法探讨[J]. 广东药学院学报, 2004, 20(5): 498-500.

[2] 龙云, 周旭光, 冯建章, 等. 食品中多巴胺测定方法研究[J]. 北京大学学报: 自然科学版, 1994, 30(4): 425-428.

[3] 潘自红, 贺国旭, 胡小明, 等. 分光光度法测定盐酸多巴胺的含量[J]. 分析试验室, 2011, 30(11): 89-91.

[4] 王术皓, 杜凌云, 魏新庭, 等. 反相流动注射-化学发光法测定盐酸多巴胺[J]. 光谱学与光谱分析, 2005, 25(5): 678-680.

[5] 牛凌梅, 马莉, 丁月新, 等. 流动注射化学发光法测定多巴胺[J]. 中国卫生检验杂志, 2008, 18(11): 2204-2205.

[6] 牛凌梅, 连靠奇, 康维钧, 等. 流动注射化学发光法测定微透析液中的多巴胺[J]. 中国卫生检验杂志, 2010, 20(2): 235-236.

[7] 马新颜, 张萍萍. 流动注射化学发光测定血浆中的多巴胺[J]. 光谱实验室, 2012, 29(6): 3875-3878.

[8] 陈志兵, 陈玉, 徐基贵, 等. 功能性 CdTe 量子点荧光增敏法测定盐酸多巴胺[J]. 分析试验室, 2010, 29(12): 5-7.

[9] 颜梅, 葛慎光, 卢娟娟, 等. 基于双分子识别荧光猝灭法高选择性测定多巴胺[J]. 分析化学, 2011, 39(11): 1711-1715.

[10] 陈亚红, 任凯, 田丰收, 等. 酶催化荧光光谱法测定盐酸多巴胺[J]. 光谱实验室, 2011, 28(2): 747-750.

[11] 吴予明, 常爱武, 张洪权, 等. 高效液相色谱法检测尿中儿茶酚胺及临床应用[J]. 中国卫生检验杂志, 2000, 10(5): 526-528.

[12] 乔坤云, 高继玲. 高效液相色谱法测定尿液中儿茶酚胺类物质[J]. 分析科学学报, 2005, 21(2): 219-220.

[13] 牛凌梅, 康维钧, 连靠奇, 等. 2, 3-二巯基丁二酸修饰金电极伏安法同时测定肾上腺素及多巴胺[J]. 理化检验: 化学分册, 2010, 46(11): 1256-1259.

[14] 陈德志, 陈巧辉, 甘惠贞, 等. 多巴胺检测新方法的研究[J]. 中国药业, 2012, 21(24): 65-67.

[15] 孙瑶, 上官恩波, 李晶, 等. 预阳极化碳糊电极同时测定对乙酰氨基酚和多巴胺[J]. 分析实验室, 2013, 32(6): 59-62.

[16] 邢宪荣, 廉文静, 刘素. 一种多巴胺分子印迹的电化学传感器[J]. 济南大学学报: 自然科学版, 2012, 26(3): 255-259.

[17] 董晓东, 于朝云, 杨慧. 电化学金属量子线传感器研究及其应用[J]. 医学研究与教育, 2011, 28(1): 19-22.

[18] 董晓东, 张柏林, 夏勇. 电化学方法制备银量子线及表征[J]. 河北大学学报: 自然科学版, 2011, 31(2): 171-175.

[19] DONG Xiaodong, LIU Junhua, ZHANG Bailin, et al. Surface structural analysis of electrochemically fabricated Ag quantum wire by its interactions with NH3 molecules in an aqueous environment[J]. Electrochimica Acta, 2012, 74:78-82.

（责任编辑：刘俊华）

Study on detection method for cerebral neurotransmitter dopamine

ZHANG Qingyun, LI Jialin, ZHENG Pei, LI Yanxia, CHE Yuxuan, DONG Xiaodong
(College of Basic Medical Sciences of Hebei University, Baoding 071000,China)

Dopamine is a special neurotransmitter in human brain, and the abnormal changes of its content will result in the emergence of clinic illness, such as Parkinson's disease. How to detect the dopamine simply and quickly is an important topic concerned by the researchers all over the world. The usual detection methods include spectrophotometry, chemiluminescence method, chemical fluorescence method, liquid chromatography, electrochemical method, et al. In this article the studies of detection methods for dopamine in recent years are reviewed.

dopamine; neurotransmitter; Parkinson's disease; detection

O65

A

1674-490X(2014)01-0087-04

2013-12-24

河北省自然科学基金项目（B2011201101）；河北大学医工交叉研究基金项目（BM201108）；河北大学医学学科专项基金项目（2012A1003）；国家级大学生创新创业训练计划项目（201310075018）；河北大学大学生创新创业训练项目（2012085）

张庆云（1992—），女，河北邢台人。

董晓东（1976—），男，吉林洮南人，副教授，博士，硕士生导师，主要从事电化学生物传感器研究。E-mail: xddong@hbu.edu.cn