翡翠贻贝多糖对宫颈癌细胞凋亡及miRNA-34a表达的影响

赖银璇，何冬梅，杨丽梅，刘新光，李江滨

（1. 广东医学院附属医院妇产科，广东 湛江 524023；2. 惠州市中医医院妇产科，广东 惠州 516001；3. 广东医学院医学检验学院，广东 东莞 523808）

·基础研究·

翡翠贻贝多糖对宫颈癌细胞凋亡及miRNA-34a表达的影响

赖银璇1，何冬梅2，杨丽梅3，刘新光3，李江滨3

（1. 广东医学院附属医院妇产科，广东 湛江 524023；2. 惠州市中医医院妇产科，广东 惠州 516001；3. 广东医学院医学检验学院，广东 东莞 523808）

目的 观察翡翠贻贝多糖对体外培养宫颈癌细胞凋亡及miRNA-34a表达的影响。方法100 mg/L翡翠贻贝多糖处理宫颈癌细胞48 h后，流式细胞术分析细胞凋亡情况，实时定量PCR检测宫颈癌细胞中miRNA-34a表达。结果 与对照组相比，翡翠贻贝多糖处理后的宫颈癌细胞凋亡率显著增加（P＜0.001），同时宫颈癌细胞中miRNA-34a表达增加（P＜0.01）。 结论 翡翠贻贝多糖通过上调miRNA-34a表达诱导宫颈癌细胞凋亡。

翡翠贻贝；多糖；宫颈癌；细胞凋亡；miRNA

现代药理学研究表明，从贻贝中提取到的多种活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用[1]。翡翠贻贝多糖（perna viridis polysaccharides，PVPS）是以翡翠贻贝肉为原料，制备得到的多糖成分。本课题组在之前的研究中观察到翡翠贻贝多糖有良好的直接抑制宫颈癌肿瘤细胞生长的作用，同时还能显著改善荷瘤模型小鼠的免疫功能，提高T淋巴细胞增殖能力和IL-2分泌[2-4]。微小RNA （microRNA，miRNA）是一类长度约为21个核苷酸、进化上高度保守的非编码单链RNA分子。miRNA具有广泛的基因调节功能，能对基因活动的各个层面进行调节，近年来，随着对miRNA研究的兴起，发现miRNA在细胞凋亡的调控中起着至关重要的作用。在肿瘤发生发展过程中，miRNA通过调节癌基因或抑癌基因的表达，参与癌细胞重要的细胞生物程序的调控[5]。miRNA-34a表达的下调或缺失与肿瘤的发生和细胞增殖之间存在着联系[6-7]，表明miRNA-34a对抑制细胞增殖，激活细胞凋亡途径有重要意义。为进一步探讨翡翠贻贝多糖是否通过调控miRNA-34a表达而诱导宫颈癌肿瘤细胞凋亡，本研究以翡翠贻贝多糖作用于人宫颈癌Hela细胞株，检测其对宫颈癌细胞凋亡及miRNA-34a表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

人宫颈癌Hela细胞株，由广东医学院衰老研究所提供。

1.1.2 试剂

小牛血清（杭州四季青生物工程有限公司），DMEM（GIBCO公司），胰酶细胞消化液（Beyotime公司），细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术研究所），miRNA-34a引物（上海吉玛试剂公司），定量PCR法miRNA检测试剂盒（Exiqon公司），翡翠贻贝多糖（PVPS）由广东医学院检验医学研究所提供，多糖含量83.5%，实验时用无血清培养液配制成相应浓度药液，过滤除菌后备用。

1.1.3 器材

FACSCanto2流式细胞仪（BD公司）；7500型荧光定量PCR仪（ABI公司）；Synergy2多功能酶标仪（Biotek）；XD-101倒置显微镜（OLYMPUS）；CO2培养箱（RSBiotech）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人宫颈癌细胞在含10%小牛血清的DMEM培养液中，37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 给药

取对数生长期的宫颈癌细胞经0.25%胰蛋白酶消化，重悬后，按每孔5 ×104个细胞加入12孔板，每孔1 mL细胞悬液，设对照组和实验组，每组4孔。细胞贴壁后，实验组加入50 μL翡翠贻贝多糖药液，使翡翠贻贝多糖终浓度为100 mg/L，对照组加入50 μL细胞培养液。培养48 h后，检测细胞凋亡及miRNA-34a表达。

1.2.3 流式细胞术分析细胞凋亡情况

按细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 实时定量PCR检测miRNA-34a表达

采用实时定量PCR法，按miRNA检测试剂盒说明书进行操作。

1.2.5 统计分析

采用SPSS17.0软件进行两组间比较t检验。

2 结 果

2.1 对细胞凋亡的影响

给药作用48 h后，翡翠贻贝多糖实验组宫颈癌细胞凋亡率为40.1%±6.6%，对照组宫颈癌细胞凋亡率为7.5%±2.0%，翡翠贻贝多糖实验组宫颈癌细胞凋亡率升高，差异有统计学意义（t=22.92，P =0.000）。

2.2 对miRNA-34a表达的影响

给药作用48 h后，对照组宫颈癌细胞miRNA-34a表达相对值为1.11±0.14，翡翠贻贝多糖实验组宫颈癌细胞miRNA-34a表达相对值为2.45±0.55，翡翠贻贝多糖实验组miRNA-34a表达升高，差异有统计学意义（t =6.93，P =0.006）。

3 讨 论

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，中国每年宫颈癌新发病例超过13万，约3万妇女死于宫颈癌，严重影响妇女的生活健康，研究宫颈癌的药理机制对宫颈癌的诊疗具有重要的意义。miRNA-34a的非正常表达出现在不同类型的肿瘤中。Soichiro等[6]研究发现，miRNA-34a可通过靶向c-Myc癌基因抑制肾癌细胞的恶变。Tivnan等[7]对神经细胞瘤的研究发现，miRNA-34a基因经常缺失，同时人为提高miRNA-34a的表达能够抑制肿瘤细胞增殖，并激活细胞凋亡途径，表明miRNA-34a对抑制细胞增殖、激活细胞凋亡途径有重要意义。课题组前期工作表明，翡翠贻贝多糖能抑制肿瘤细胞生长[2-3]，但其分子机制尚不清楚。为了探讨翡翠贻贝多糖是否通过调控miRNA表达而诱导肿瘤细胞凋亡，本课题组在前期实验中观察了miRNA-34a差异表达后对宫颈癌细胞增殖的影响，结果表明，miRNA-34a过表达抑制宫颈癌细胞增殖，miRNA-34a低表达促进宫颈癌细胞增殖，miRNA-34a是一种在宫颈癌细胞生长中起调控作用的miRNA，其调控宫颈癌细胞增殖的效果为负调控，类似于抑癌基因。因此调控miRNA-34a表达很可能是调控宫颈癌细胞增殖与凋亡的新的靶点。本研究在此基础上探讨了翡翠贻贝多糖是否通过调控miRNA-34a表达而诱导宫颈癌细胞凋亡，结果表明实验组宫颈癌细胞凋亡和miRNA-34a表达同时升高，提示miRNA-34a很可能是翡翠贻贝多糖调控宫颈癌细胞凋亡的药理靶点之一，翡翠贻贝多糖通过上调miRNA-34a表达，从而诱导了宫颈癌细胞的凋亡。

[1] 李江滨, 黄迪南. 贻贝的药用价值研究进展[J]. 水产科学, 2004, 23(11): 43-44.

[2] 许子茂, 李江滨, 侯敢. 翡翠贻贝多糖的制备及体外对Hela肿瘤细胞生长的抑制作用[J]. 中国现代药物应用, 2010, 4(7): 1-2.

[3] 李江滨, 何冬梅, 赖银璇, 等. 翡翠贻贝多糖抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖的实验研究[J]. 中国现代药物应用, 2011, 5(1): 17-18.

[4] 许子茂, 李江滨, 侯敢. 翡翠贻贝多糖对荷瘤小鼠的抗肿瘤和免疫功能调节作用[J]. 中国现代药物应用, 2010, 4(9): 15-16.

[5] 刘禹, 姜晓峰. MicroRNA与肿瘤的研究进展[J]. 国际检验医学杂志, 2010, 31(5): 465-467.

[6] SOICHIRO Y, SHARANJOT S, SHAHANA M, et al. MicroRNA-34a suppresses malignant transformation by targeting c-Myc transcriptional complexes in human renal cell carcinoma[J]. Carcinogenesis, 2012, 33(2): 294-300.

[7] TIVNAN A, TRACEY L, BUCKLEY P G, et al. MicroRNA-34a is a potent tumor suppressor molecule in vivo in neuroblastoma[J]. BMC Cancer, 2011, 11: 33.

（责任编辑：刘俊华）

Effects of perna viridis polysaccharides on apoptosis of cervical cancer cell and expression of miRNA-34a

LAI Yinxuan1, HE Dongmei2, YANG Limei3, LIU Xinguang3, LI Jiangbin3
(1. Department of Gynaecology and Obstetrics, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China; 2. Department of Gynaecology and Obstetrics, Chinese Medicine Hospital of Huizhou City, Huizhou 516001, China; 3. School of Laboratory Medicine, Guangdong Medical College, Dongguan 523808, China)

Objective To investigate the effects of perna viridis polysaccharides (PVPS) on apoptosis of cervical cancer cell and expression of miRNA-34a. Methods Cervical cancer cells were treated with PVPS (100 mg/L) for 48 hours, then flow cytometry was used to analyse apoptosis and real-time quantitative PCR to detect expression of miRNA-34a. Results Compared with control group, PVPS can significantly rise the apoptosis rate (P＜0.001) and expression of miRNA-34a (P＜0.01) in cervical cancer cell. Conclusion PVPS can induce apoptosis of cervical cancer cell by elevate expression of miRNA-34a.

perna viridis; polysaccharides; cervical cancer; apoptosis; miRNA

R966

A

1674-490X(2014)02-0001-03

2013-12-20

国家自然科学基金（81170327）；广东省中医药局科研课题（20121113）；湛江市科技攻关项目（2012C3101025）；广东省高等学校大学生创新创业训练计划项目（1057112048）

赖银璇（1978—），女，广东普宁人，主治医师，硕士，主要从事妇科疾病防治研究。

李江滨（1975—），男，河南新乡人，副教授，硕士，主要从事中药药理与分子医学研究。E-mail: 86971828@qq.com