7-二氟亚甲基-5，4′-二甲烷氧基异黄酮作用机制的初步研究归纳

罗 飞，刘茵茵(综述)，符晓华(审校)

(湖南师范大学医学院，长沙 410013)

金雀异黄素是一种大豆体内天然存在的异黄酮类物质,有抗动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)和稳定其斑块的作用[1],但它生物利用度差，从而限制了它在治疗心血管疾病和脑血管疾病中的应用。符晓华[2]以金雀异黄素为先导化合物，在其C-7位选择性引入二氟亚甲基，同时5，4′位引入系列烷氧基，设计和合成了9个7-二氟亚甲基-5，4′-取代烷氧基异黄酮(7-difluoromethoxy-5,4′-dimethoxygenistein，DFMG)新化合物。以H2O21.0 mmol处理人脐静脉内皮细胞(HUVEC-12细胞)24 h作为血管内皮氧化应激损伤模型，筛选对血管内皮氧化应激损伤具有保护作用的活性新化学实体。在筛选中发现DFMG抗血管内皮氧化应激损伤作用效价强度较其他新化合物强，且为先导物金雀异黄素的100倍。现就DFMG对As作用机制的初步研究进行归纳。

1 DFMG的体内实验研究

1.1DFMG抗As的作用机制 Zhao等[3]通过As兔模型研究发现，DFMG对As的作用主要有：减缓As的发展；降低血清中的总胆固醇和低密度脂蛋白的水平；减少脂质的过氧化；增加平滑肌细胞和胶原的数量，稳定As斑块。游计良等[4]通过As兔模型研究发现，DFMG有较强的抗As的作用，其机制可能是：高水平的内皮素1(endothelin-1，ET-1)具有促进As形成的作用[5]，DFMG可显著降低As血管中ET-1水平。其可能是通过抑制ET-1 mRNA表达来减少ET-1蛋白的分泌。一氧化氮生成减少可以导致血管张力异常,使血流剪切力改变,从而损伤内皮细胞，促使As发生[6]。DFMG能使血管内一氧化氮水平显著升高，其机制可能是通过增强人血管内皮细胞一氧化氮合酶基因转录和蛋白合成,导致一氧化氮的产生增多。高同型半胱氨酸可促进As的形成[7]，DFMG能降低血管中的同型半胱氨酸。

1.2DFMG稳定As斑块的作用机制 As斑块的稳定性主要取决于斑块的内部成分，而与斑块的大小、多少、位置及管腔狭窄程度无关[8]。李程等[9]通过实验发现，DFMG作用于家兔As模型可以稳定其胸主动脉的As斑块。其机制可能是通过影响As斑块内的平滑肌细胞数量和胶原的含量而使粥样斑块的大小趋于稳定。在对家兔As模型进行DFMG干预的实验中，发现DFMG处理的As家兔模型的胸主动脉斑块中胶原含量比模型对照组、金雀异黄素组和洛伐他汀组显著增加[9]。其机制可能是DFMG通过抗血管内皮炎性反应机制，抑制血管内皮细胞表达金属蛋白酶和干扰素γ的形成来抑制胶原分解促进胶原形成，从而稳定As斑块。Zhao等[3]研究发现，DFMG能增加平滑肌细胞和胶原的数量，稳定As斑块。由此可见，如何稳定As斑块，从而减少患者发生更为严重的斑块破裂、动脉瘤、血管栓塞等在临床上显得更为重要。

2 DFMG的体外实验研究

2.1DFMG对血管内皮细胞的保护作用 Fu等[10]研究表明，DFMG对血管内皮氧化应激损伤有保护作用。其特点主要有：①DFMG呈浓度依赖性的降低H2O2诱导血管内皮细胞乳酸脱氢酶的释放。②DFMG呈浓度依赖性的提高H2O2孵育后的内皮细胞成活率。Wang等[11]研究发现，DFMG能拮抗H2O2诱导内皮细胞凋亡。游计良等[12]研究发现，DFMG能改善乙酰胆碱诱导的血管内皮细胞依赖性舒张功能，对其进行保护。谭锦盛等[13]研究发现，DFMG拮抗溶血性磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine，LPC)诱导人脐静脉内皮细胞凋亡且与其阻断细胞活性氧类产生及由活性氧类激发的线粒体凋亡途径有关。其机制主要有：DFMG可拮抗LPC上调细胞色素C、磷酸化c-Jun氨基端激酶、多腺苷二磷酸核糖聚合酶蛋白等与线粒体凋亡途径密切相关的蛋白的表达，从而阻断活性氧类促发的线粒体凋亡途径。邢小伟等[14]研究发现，DFMG拮抗LPC诱导人脐静脉内皮细胞凋亡且其机制与阻断角蛋白18磷酸化表达有关。Liu等[15]研究表明，DFMG能有效地保护血管内皮细胞。其研究发现，DFMG拮抗溶血性LPC诱导的内皮细胞损伤作用大于三羟异黄酮和维生素E，并发现其机制可能与线粒体凋亡途径有关，并且都有力地证实了DFMG对血管内皮细胞具有较好的保护作用。Chapman[16]提出血管内皮细胞受损和功能改变是As发生、发展的始动环节。Wei等[17]也提出内皮细胞损伤和凋亡是As发生早期的重要事件。那么，没有内皮细胞损伤就难以形成As，也难以进一步发展恶化，因此DFMG可能有预防As的形成，阻止其进一步发展的作用。

2.2DFMG对血管内皮细胞E-选择素、细胞间黏附分子1释放的影响 王莉等[18]证明DFMG有抑制氧化应激损伤诱导的血管内皮细胞E-选择素、细胞间黏附分子1释放的作用，从而拮抗氧化诱导的内皮细胞与单核细胞黏附的作用。进一步实验发现，H2O2可诱导血管内皮细胞磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(diphosphorylated-extracellular signal-regulated kinase1/2，p-ERK1/2)表达上调,DFMG可下调内皮细胞p-ERK1/2的表达。DFMG可能通过抑制ERK1/2的磷酸化,进而抑制氧化诱导的内皮细胞与单核细胞的黏附。Wang等[11]发现，DFMG可以有效地抑制氧化应激和炎症诱导的血管内皮细胞和单核细胞之间的黏合，其机制与核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)的下调密切相关。Motawi等[19]研究表明，脑血管及心血管As患者中E-选择素和细胞间黏附分子1的基因突变的频率显著高于对照组，其有促进As形成的趋势，抑制E-选择素、细胞间黏附分子1释放有利于拮抗As的发生、发展。

2.3DFMG对血管内皮细胞白细胞介素6和肿瘤坏死因子α释放的影响 研究发现，DFMG能有效抑制氧化应激损伤血管内皮细胞炎性因子白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)、肿瘤坏死因子α的释放[9]。研究发现，IL-6通过有丝分裂原活化蛋白激酶和Jun激酶途径下调As斑块的稳定性[20]。van der Valk等[21]也提出了拮抗IL-6产生等的As的新型抗炎战略，其部分药物已达临床开发阶段。肿瘤坏死因子α可通过介导内皮细胞损伤、破坏凝血-抗凝血平衡、促进黏附分子产生、促进基质金属蛋白酶表达等促进As发生[22]。DFMG可能是一种以拮抗IL-6等因子产生的抗As新型活性化学实体。

2.4DFMG对血管内皮细胞NF-κB活性的影响 Madonna等[23]提出过量或不适当的NF-κB的激活可导致人发生炎性疾病，包括As等,而其作为一个潜在的治疗As的新靶点已在临床上的得到应用和重视。王莉等[18]在实验中发现，H2O2可诱导血管内皮细胞NF-κB表达上调和活性增加，而DFMG可拮抗氧化应激损伤诱导血管内皮细胞NF-κB的表达上调和活性的增加以达到保护内皮细胞的目的。Fu等[10]发现，DFMG可以下调NF-κB的表达。

2.5DFMG与血管内皮细胞线粒体凋亡途径 研究表明，胱天蛋白酶3(caspase-3)表达上调与As发生有关[24]。Park等[25]也有类似的研究，证明了内皮细胞死亡与caspase-3的活化密切相关。Wang等[11]研究发现，DFMG能抑制H2O2诱导的内皮细胞caspase-3的上调。李程等[9]研究表明，DFMG可能通过降低H2O2处理的血管内皮细胞活性氧类的产生，阻断死亡受体和线粒体凋亡信号转导途径下调的活性。

2.6DFMG对血管内皮细胞ERKl/2蛋白和角蛋白18磷酸化的影响 ERKI/2磷酸化增加内皮细胞与中性粒细胞的黏附，而ERK1/2磷酸化受到抑制时，氧化应激损伤得到一定程度逆转[26]。 王莉[18]研究表明，DFMG可下调氧化应激损伤诱导的内皮细胞磷酸化ERKl/2的表达，说明DFMG能使内皮细胞的氧化应激损伤得到一定程度的逆转。邢小伟等[27]研究发现，LPC可使人脐静脉血管内皮细胞(HUVE-12细胞)Ser33位和Ser52位磷酸化角蛋白18表达上调，而DFMG对此有拮抗作用。角蛋白18的活化可能通过调节Fas配体相关的死亡诱导信号复合物的形成，参与调节细胞凋亡[28]。

3 展 望

现有的对于DFMG抗As作用机制的初步研究大部分是围绕其对内皮细胞的保护作用开展的。早在1993年Ross[29]就发现血管平滑肌细胞异常增殖在As斑块形成过程中发挥重要作用，近年来对于血管平滑肌的研究也是热点。关于DFMG抗As机制中是否涉及抑制早期细胞增殖与迁移和保护斑块内的平滑肌细胞是十分必要的。在DFMG的毒理学方面的研究较少，也是今后必不可少的研究课题。

前期研究已经证实DFMG有较好的抗As的作用，其机制的初步研究中发现其作用途径不完全与经典抗As药物相同，提示DFMG具有强大的潜力，很有可能成为新一代疗效显著的抗As的药物。但其在临床的应用还有很长的距离，尚需要进行更多的研究来推动DFMG的发展以及其他抗As药物研究的发展。

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