LAMP技术及其在转基因检测中应用研究进展

陈 曦，张明哲，吴志毅，林晓佳，陈吴健，夏 拯

（浙江省检验检疫科学技术研究院,浙江杭州 310016）

LAMP技术及其在转基因检测中应用研究进展

陈 曦，张明哲，吴志毅，林晓佳，陈吴健，夏 拯

（浙江省检验检疫科学技术研究院,浙江杭州 310016）

LAMP技术由于其检测灵敏度高、检测特异性强、操作简单、快速高效等优点,已在转基因检测领域中得到广泛应用。本文简要综述该技术的原理、发展过程及其在转基因领域中应用研究的进展。

LAMP；转基因检测；进展；应用

近年来,转基因作物发展速度迅猛,至2012年全球转基因作物种植面积达到1.703亿hm2,比2011年的1.6亿hm2增长6%,即1 030万hm2。而在中国同样种植了约400万hm2的转基因棉花。随着转基因作物种植面积的增加,对于转基因产品的争议也越来越大。一方面,中国农业部在2009年审放了转基因耐除草剂水稻Bt汕优63等3个转基因农作物的生产应用安全证书；在2013年审放了抗除草剂大豆CV127等3个品系的转基因大豆进口用作加工原料的农业转基因生物安全证书。另一方面,近年中国出口的米制品屡遭欧盟通报；2008,2011年先后2次对中国出口米制品发布决议,对其抽查范围、检测力度都有加强。如何快速准确地检测转基因产品,成为了目前热门的课题之一。

2000年由Notom i等［1］发明的环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种新的恒温核酸扩增方法,相较于传统的核酸扩增方法,具有检测灵敏度高、检测特异性强、操作简单、快速高效的优点,因此越来越多被应用于转基因检测中。

l LAMP技术的原理

1AMP技术在可使核酸扩增的65℃恒温条件下进行,其扩增效率可达10亿～100亿个拷贝数量级。其主要原理是通过采用特异地识别靶序列上6个区域的4条引物（2条内引物-FIP/BIP,2条外引物-F3/B3）及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶,将扩增反应步骤分为2个部分进行哑铃状模板构造的形成与循环扩增［2］。如图1所示,65℃左右时,FIP引物在Bst酶作用下以F2区段的3′末端为起点,与模板DNA互补序列配对,启动链置换DNA合成（1～2）。F3引物与F2c前端F3c序列互补,以3′末端为起点,通过链置换型DNA聚合酶的作用,一边置换先头FIP引物合成的DNA链,一边合成自身DNA,如此向前延伸（3）。最终F3引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链（4）。由FIP引物先合成的DNA链被F3引物进行链置换产生一单链,这条单链在5′末端存在互补的F1c和F1区段,于是发生自我碱基配对,形成单边环状结构（5）。同时这条单链DNA,又可作为模板,在另一端结合BIP引物和B3引物合成一条双链,并置换出一条单链DNA（6～7）。此时,被置换的单链DNA两端都存在互补序列,自我碱基配对后整条链呈现哑铃状构造（8）。

图1 哑铃状模板构造的形成过程

如图2所示,上述过程中最后形成的哑铃状模板构造是循环反应的原料。在循环反应中,首先在哑铃状结构中,以3′末端的F1区段为起点,以自身为模板,进行DNA合成延伸。与此同时,FIP引物F2与环上单链F2c杂交,启动新一轮链置换反应。解离由F1区段合成的双链核酸。同样,在解离出的单链核酸上也会形成环状结构。在环状结构上存在单链形式B2c,BIP引物上的B2与其杂交,启动新一轮扩增。最终形成如花椰菜样的茎-环结构DNA组成的混合物,即由在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。整个反应仅需1 h,具有简便、快速、准确等特点。

图2 LAMP反应扩增循环过程

2 LAM P技术的发展

1AMP技术自从2000年发明至今已有10余年,除直接检测扩增产物外,还可对扩增反应过程进行实时监控,提高了检测准确性,达到定量检测的目的。目前对于LAMP技术的实时检测方法有2种浊度法与荧光染色法。

2.1 浊度法

Mori等［2］研究了LAMP反应中焦磷酸镁沉淀的形成与扩增产物的量之间的关系,发现两者生成量之间呈线性关系,且焦磷酸镁沉淀在400 nm处有吸收峰。日本荣研株式会社通过该原理研制出了专门用于LAMP检测的实时监控浊度仪,并被广泛应用。如Mori等［3］通过监测焦憐酸镁产生的量,从而间接监测LAMP产物的扩增情况,推算待检测物质双链DNA的起始拷贝数,达到定量检测的效果。吴少云等［4］利用浊度仪实时监测扩增过程,建立Bt63品系的快速检测技术体系,并对反应温度、灵敏度、特异性、稳定性和实际样品检测能力进行初步探索。

2.2 荧光染色法

Nagam ine等［5］最早将荧光染料SYBR Green I与LAMP技术结合,通过监测荧光染料与DNA双链结合所产生的信号强度,参照标准曲线,确认扩增反应初始拷贝数,达到了定量检测的效果。目前该方法既可通过荧光定量PCR检测,也可通过专用的恒温扩增PCR仪（如GENIE II等）进行检测。如Bühlmann等［6］利用GENNIE II对Erωinia amyloυora进行检测研究,并与实时荧光PCR进行比较,发现其检测低限可达102·m L-1。

3 LAM P技术在转基因检测中的发展

1AMP法广泛应用于包括病毒［7-9］、细菌［10-12］等传染性疾病的定性和定量检测。近年逐渐开始用于转基因作物检测领域。随着转基因检测的发展与LAMP技术的成熟,其检测方向经过了由外源基因检测到品系检测的发展过程。

3.1 转基因外源基因检测

2004年,Fukuta等［13］利用LAMP技术对转基因大豆中CaMV35S基因进行检测,验证了LAMP技术在转基因检测中应用的可能性,并进行LAMP技术检测检测灵敏度实验,发现其检测低限在0.5%。在国内,周琳华等［14］以转基因玉米MON810为模板,针对Cry1A（b）抗虫基因核酸保守序列设计特异性引物,建立LAMP检测体系。王永等［15］利用LAMP技术对另一种抗虫基因Cry1A（c）进行了研究,同样证明该方法可特异性地检测Cry1A（c）基因,且检测灵敏度比普通PCR要低10倍。

3.2 转基因品系检测

近年来,转基因检测研究方向逐步从外源基因检测转变为品系检测［16-18］,LAMP技术在这方面也有着广泛的研究。Lee等［19］针对MS8、RF3两种转基因油菜品系建立了转基因油菜的LAMP快速检测方法,检测限达到0.01%。在转基因玉米检测方面,凌莉等［20］建立了转基因玉米Bt176 LAMP检测体系；兰青阔等［21］建立了转基因玉米MON863 LAMP检测体系；张隽等［22］建立了转基因玉米MON89034 LAMP检测体系；在2011年,Chen等［23］成功建立了特异性检测7种转基因玉米品系的LAMP法,用凝胶电泳和添加SYBIGreen I 2种方法来观察结果,并用建立的方法对实际样品中的转基因玉米成分做检测。其他如转基因大米Bt63［4］、转基因大豆GTS 40-3-2和MON89788［24］等许多转基因品系均已建立了LAMP检测体系。

4 LAM P技术在转基因检测中的应用前景

1AMP技术虽然起步较晚,且存在着如假阳性、气溶胶污染等问题,但由于该技术检测灵敏度高、检测特异性强、操作简单、快速高效的优点,已在转基因检测领域中得到深入研究与应用。且该技术不需复杂仪器操作,随着相关技术的不断研究与发展,将在检验检疫等一线工作中占有一席之地,成为转基因检测的一种重要检测手段。

［1］ Notom i T,Okayama H,Masubuchi H,et al.1oop-mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Res, 2000,28（12）：63.

［2］ Mori Y,Nagamine K,Tomita N,et al.,Detection of loopmediated isothermal amp lification reaction by turbidityderived from magnesium pyrophosphate formation［J］.Biochem Biophys Res Commun,2001,289（1）：150-154.

［3］ Mori Y,Kitao M,Tom ita N,et al.Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA［J］.J Biochem Biophys Methods,2004,59：145-157.

［4］ 吴少云,唐大运,李琳,等.1AMP实时浊度法检测转基因水稻Bt63品系［J］.食品与机械,2012,28（5）：79-82.

［5］ Nagamine K,Hase T,Notomi T,et al.Accelerated reaction by loop mediated isothermal amplification using loop primers［J］.Mol Cell Probes,2002,16：223-229.

［6］ Bühlmann A,Pothiera J,Rezzonico F,et al.Erωinia amyloυora loop-mediated isothermal amplification（LAMP）assay for rapid pathogen detection and on-site diagnosis of fire blight［J］.JM icrobiol Methods,2013,92：332-339.

［7］ Yoshikawa T,Ihira M,Akimoto S,et al.Detection of human herpesvirus 7 DNA by loop-mediated isothermal amp lification［J］.JClin Micobiol,2004,42（3）：1348-1352.

［8］ Mori N,Motegi Y,Shimamura Y,et al.Development of a new method for diagnosis of Rubella virus infection by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification［J］.J Clin Micobiol,2004,44（9）：3268-3273.

［9］ Parida M M,Santhosh S R,Dash P K,et al.Development and evaluation of reverse transcription loop mediated isothermal amplification assay for rapid and real-time detection of Japanese Encephalitis virus［J］.J Clin Micobiol,2006,44（11）：4172-4178.

［10］ Hara-Kudo Y,Yoshino M,Kojima T,et al.1oop-mediated isothermal amplification for the rapid detection of Salmonella［J］.FEMSM icrobiol Lett,2005,25：155-161.

［11］ Seki M,Yamashita Y,Torigoe H,et al.1oop-mediated isothermal amplification method targeting the lytA gene for detection of Streptococcus pneumoniae［J］.JClin M icobiol, 2005,43（4）：1581-1586.

［12］ Song Tianyan,Toma C,Nakasone N,et al.Sensitive and rap id detection of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli by a loop-mediated isothermal amplification method［J］.FEMS M icrobiol Lett,2005,243：259-263.

［13］ Fukuta S,Mizukam i Y,Ishida A,et al.Real-time loopmediated isothermal amplification for the CaMV-35S promoter as a screening method for genetically modified organisms［J］. Eur Food Res Technol,2004,218：496-500.

［14］ 周琳华,肖维威,吴永彬,等.苏云金芽孢杆菌Cry1A（b）抗虫基因LAMP检测方法的建立与应用［J］.生物技术通报,2012（4）：165-169.

［15］ 王永,兰青阔,赵新,等.抗虫转Bt基因水稻外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用［J］.植物生理与生物技术,2012,18（1）：7-10.

［16］ Holck A,Vaitilingom M,Didierjean L,et al.5，-Nuclease PCR for quantitative event-specific detection of the genetically modified Mon810 MaisGard maize［J］.Eur Food Res Technol, 2002,214：449-454.

［17］ Yang L T,Xu S C,Pan A H,et al.Event specific qualitative and quantitative polymerase chain reaction detection of genetically modified MON863 maize based on the 5，-transgene integration sequence［J］.J Agri Food Chemy,2005,53：9312-9318.

［18］ Shen K L,Li X,W ang S,et al.Establishment and in-house validation of simplex and duplex PCR methods for eventspecific detection ofmaize SYN-E3272-5 using a new referencemolecule［J］.JAOAC In,2010,93：663-675.

［19］ Lee D,La Mura M,A llnutt TR,et al.Detection of genetically modified organisms（GMOs）using isothermal amplification of target DNA sequences［J］.BMC Biotechnol, 2009（9）：7.

［20］ 凌莉,刘静宇,易敏,等.转基因玉米Bt176品系特异性环介导等温扩增检测方法的研究［J］.食品工业科技, 2013（3）：310-313.

［21］ 兰青阔,王永,赵新,等.环状等温扩增技术快速检测转基因玉米MON863的研究［J］.玉米科学,2011,19（1）：31-34.

［22］ 张隽,李志勇,叶宇鑫,等.环介导等温扩增法检测转基因玉米MON89034［J］.现代食品科技,2012,28（4）：469-472.

［23］ Chen L L,Guo J C,Wang Q D,et al.Development of the visual loop-mediated isothermal amplification assays for seven genetically modified maize events and their application in practical samp les analysis［J］.J Agric Food Chem,2011, 59：5914-5918.

［24］ Guan X Y,Guo J C,Shen P,et al.Visual and rapid detection of two genetically modified soybean even ts using loopmediated isothermal amplification method［J］.Food Anal Methods,2010（3）：313-320.

（责任编辑：张瑞麟）

TS 207.3

A

0528-9017（2014）03-0393-03

文献著录格式：陈曦,张明哲,吴志毅,等.1AMP技术及其在转基因检测中应用研究进展［J］.浙江农业科学,2014（3）：393-395.

2013-10-13

国家质检总局科技计划项目（2011IK249）；浙江省科技厅公益性项目（2011C22065）；浙江省科技厅重大专项（2011C12023）；浙江出入境检验检疫局科研项目（ZK200958）

陈 曦（1986-）,男,助理农艺师,硕士,主要从事植物检疫工作。E-mail：cx9201@163.com。