脂联素受体1结合蛋白表达抑制对脂联素抗小鼠心肌缺血／再灌注损伤作用的影响

王 正，金振晓，易 蔚，易定华

·基础研究·

脂联素受体1结合蛋白表达抑制对脂联素抗小鼠心肌缺血／再灌注损伤作用的影响

王 正，金振晓，易 蔚，易定华

目的 观察脂联素（APN）受体1结合蛋白（APPL1）表达抑制对APN抗小鼠心肌缺血／再灌注（MI／R）保护作用的影响。方法 采用小鼠在体MI／R动物模型，APPL1表达抑制采用心肌内注射特异性小干扰RNA（APPL1 SiRNA）1 μg／g体重方法实现，再灌注前10 min经腹腔注射给予APN蛋白球状片段（gAPN）2 μg／g体重或等量生理盐水。70只实验小鼠随机分为5组：假手术组（Control），MI／R＋Scramble SiRNA（无关对照SiRNA）组，MI／R＋APPL1 SiRNA组，MI／R＋Scramble SiRNA＋gAPN组，MI／R＋APPL1 SiRNA＋gAPN组。再灌注3 h后（n＝6），取心肌组织进行Western Blot分析APPL1含量，再灌注24 h后（n＝8）对小鼠进行超声心动图心功能检测和心肌梗死面积测定。结果 再灌注3 h后，APPL1 SiRNA注射小鼠的心肌组织中APLL1表达量较Control组及无关对照SiRNA组注射小鼠明显降低（P＜0.01）。MI／R＋APPL1 SiRNA组与MI／R＋Scramble SiRNA组比较，左室射血分数和心肌梗死面积无显著差异。与MI／R＋Scramble SiRNA组相比，MI／R＋Scramble SiRNA＋gAPN组和MI／R＋APPL1 SiRNA＋gAPN组的左室射血分数明显升高（P＜0.01），心肌梗死面积明显降低（P＜0.01）。与MI／R＋Scram⁃ble SiRNA＋gAPN组相比，MI／R＋APPL1 SiRNA＋gAPN组的左室射血分数明显降低（P＜0.01），心肌梗死面积明显增加（P＜0.01）。结论 APPL1表达抑制可导致APN抗小鼠MI／R损伤保护作用的明显减弱。

心肌保护；脂联素；缺血／再灌注损伤；APPL1

脂联素（Adiponectin，APN）是一种主要由脂肪细胞分泌的细胞因子，具有调节代谢、血管内皮保护、抗炎症反应、以及抗心肌缺血／再灌注（myocar⁃dia ischemic／reperfusion，MI／R）损伤等多种生物学功能［1－2］。APN蛋白球状片段（globular domain of Adiponectin，gAPN）是 APN的蛋白酶裂解产物。gAPN是APN主要的活性区域，在心肌保护、调节糖、脂代谢等方面具有比全长型APN更强的生物学作用［3］。APN的受体主要包括 APN受体 1（AdipoR1）、APN受体2（AdipoR2）、T－钙粘蛋白（TCadherin）等，其中AdipoR1是心肌细胞中APN的主要受体，脂联素受体结合蛋白（adaptor protein contai⁃ning PH domain，PTB domainand leucine zipper motif1，APPL1）是AdipoR1的一个关键结合蛋白［4－5］。AP⁃PL1通过与AdipoR1的蛋白－蛋白相互作用，介导了APN在多种细胞内的多条信号转导途径［6－7］。而关于APPL1和AdipoR1的相互作用是否参与调节APN的抗MI／R损伤保护作用，尚未见报道。心肌内注射APPL1特异性小干扰RNA（APPL1 SiRNA）可以显著降低心肌APPL1的表达，继而使APPL1和AdipoR1的相互作用减弱。超声心动图左室射血分数（Left ventricular ejection fraction，LVEF）可以反映心功能的改变，心肌梗死面积可以反映心肌损伤程度。本研究将以小鼠在体心肌缺血／再灌注（myocardial ischemi⁃a／reperfusion，MI／R）模型为研究对象，探讨APPL1表达抑制状态下APN抗MI／R损伤保护作用的变化。

1 材料与方法

1.1 研究对象 成年雄性C57BL／6J小鼠（8～10 w），由第四军医大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂和仪器 异氟烷（鲁南贝特制药有限公司，中国），gAPN（Sigma，美国），伊文氏蓝（Sigma，美国），2，3，5－三苯基氯化四氮唑，TTC（Sigma，美国）。SiRNA及相关转染试剂均从Invitrogen公司（美国）购得，小鼠特异性APPL1 SiRNA序列：AA⁃GAGTGGATCTGTACAATAA；小鼠无相关对照（Scramble）SiRNA序列：AATATTATTAAGGCGA⁃CAGAG。吸入麻醉机（Matrx，美国）。Visualson⁃icVevo 2100高分辨率小动物在体超声成像系统（Visualsonic，美国）。

1.3 实验分组 70只小鼠随机分为5组，假手术组（Control），MI／R＋ScrambleSiRNA（无关对照SiRNA）组，MI／R＋APPL1 SiRNA组，MI／R＋ScrambleSiRNA＋gAPN组，MI／R＋APPL1 SiRNA＋gAPN组，每组14只。每组随机取出6只小鼠，作为MI／R 3 h组，进行蛋白分析（n＝6）。每组剩下的8只小鼠作为MI／R 24 h组，进行超声心动图心功能检测（n＝8）和心肌梗死面积检测（n＝8）。

1.4 小鼠在体MI／R模型的建立及实验分组 根据文献所述［8］，2%异氟烷麻醉小鼠，通过左胸廓手术将心脏暴露于第五肋间隙，三点式心肌内注射APPL1 SiRNA（15 μl；1 μg／g体重）和 Scramble SiRNA（15 μl；1 μg／g体重）。SiRNA注射48 h后用2%异氟烷麻醉小鼠，通过左胸廓切口再次暴露心脏，用6－0手术线在冠脉左前降支距根部2～3 mm处打一活结造成心肌缺血，缺血20 min时，经小鼠腹腔注射gAPN（2 μg／g体重）或等量生理盐水，缺血30 min时，通过留在切口外的线头松开结扎线，造成心肌再灌注。心肌再灌注时间为3 h或24 h，3 h组进行蛋白分析，24 h组进行心脏功能和心肌梗死面积的测定。假手术组小鼠经过相同的手术过程，只是不结扎左冠状动脉。

1.5 小鼠超声心动图测定LVEF 小鼠MI／R 24 h后，用2%异氟烷麻醉，应用Visualsonicvevo 770高分辨率在体超声成像系统，记录小鼠超声心动图，LVEF。

1.6 伊文氏蓝／TTC染色法检测心肌梗死面积 根据文献所述［9］，小鼠MI／R 24 h后，再次原位结扎冠脉，伊文氏蓝颜料（2%）注入主动脉内，非蓝色染区为缺血区域（areaatrisk，AAR），蓝色者为正常灌注区域。摘取整个心脏，滤纸吸除多余染料，将左心室从心尖部位开始向上切为1～2 mm厚切片。切片用1%的2，3，5－三苯基氯化四氮唑（2，3，5－tripheny⁃ltetrazolium chloride，TTC）磷酸盐缓冲液在37℃孵箱中孵育20 min。TTC红染区为缺血但仍存活组织，苍白色区域为梗死心肌（Infarction area，INF）。每层切片前后均拍照片，使用Image Pro Plus图像软件分析照片不同区域面积大小，每层切片两边的区域面积取平均值，心肌梗死范围以每一心脏总INF占总缺血区（AAR）的百分比表示。

1.7 统计学方法 应用Prism统计软件进行统计分析，实验结果以均数±标准差（±s）表示，差异显著性检验采用单因素方差分析，比较二组间差异用LSD－t检验，P＜0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 心肌蛋白Western Blot分析 为了研究APPL1表达抑制对APN抗MI／R损伤保护作用的影响，笔者通过心肌点注射APPL1 SiRNA来抑制小鼠心肌APPL1的表达。Western Blot检验结果显示，MI／R＋APPL1 SiRNA组和MI／R＋APPL1 SiRNA＋gAPN组的小鼠心肌组织中APPL1表达量较Control组和无关SiRNA组显著降低（P＜0.01），见图1。

图1 Western Blot检测各组小鼠心肌中APPL1的表达量

2.2 超声心动图心功能测定 MI／R＋APPL1 SiR⁃NA组与MI／R＋Scramble SiRNA组比较，LVEF无显著差异。MI／R＋Scramble SiRNA＋gAPN组的LVEF值明显高于MI／R＋Scramble SiRNA组和MI／R＋AP⁃PL1 SiRNA组（P＜0.01），而MI／R＋APPL1 SiRNA＋gAPN组的LVEF值虽然高于MI／R＋Scramble SiRNA组和MI／R＋APPL1 SiRNA组（P＜0.05），却明显低于MI／R＋Scramble SiRNA＋gAPN组（P＜0.01）见图2。

图2 超声心动图检测各组LVEF值

2.3 心肌梗死面积的测定 MI／R＋APPL1 SiRNA组与MI／R＋ScrambleSiRNA组比较，心肌梗死面积无显著差异。MI／R＋Scramble SiRNA＋gAPN组和MI／R＋APPL1 SiRNA＋gAPN组小鼠的心肌梗死面积明显小于MI／R＋Scramble SiRNA组和MI／R＋APPL1 SiRNA组（P＜0.01），而 MI／R＋APPL1 SiRNA＋gAPN组的心肌梗死面积明显大于MI／R＋Scramble⁃SiRNA＋gAPN组（P＜0.01）见图3。

图3 伊文氏蓝／TTC染色检测心肌梗死面积

3 讨 论

APN是一种在循环系统中大量存在的脂肪细胞因子，具有显著的抗MI／R损伤功能［1－2］。其主要通过两条信号转导途径保护心肌：一条是腺通过苷酸活化蛋白激酶（AMP－activated protein kinase，AMPK）途径启动心肌细胞抗凋亡机制；另一条是通过非AMPK依赖的抗硝基化／抗过氧化途径，显著降低MI／R产生的心肌毒性极高的过氧亚硝酸基阴离子（Peroxynitrite，ONOO－）［10－11］。

AdipoR1是心肌细胞中APN的主要受体，AP⁃PL1是首个被证明可与AdipoR1发生蛋白－蛋白相互作用的转接分子，其PTB结构域（phosphotyrosine－binding，磷酸酪氨酸结合域）可直接与AdipoR1的胞内段结合［7］。多项研究表明APPL1通过与Adi⁃poR1的蛋白－蛋白相互作用，介导了APN在多种细胞内的多条信号转导途径，包括AMPK激活的抗凋亡作用［7，12－13］，而在体动物模型中关于APPL1是否参与调节APN的抗MI／R损伤作用尚未得到验证。

为了研究APPL1对APN心肌保护作用的影响，笔者采用心肌3点式注射APPL1 SiRNA抑制APPL1的表达，Western Blot结果显示，注射APPL1 SiRNA的两组APPL1表达水平明显降低（图1）。超声心动图和伊文氏蓝／TTC染色结果显示，MI／R＋Scramble SiRNA组和MI／R＋APPL1 SiRNA组无显著差异（图2，3），这难道说明APPL1的抑制对内源性APN的心肌保护作用没有影响吗？分析其中的原因，笔者认为有以下几种可能：① 在急性MI／R损伤的情况下内源性APN的表达水平降低［14］，在没有外源性给予大剂量APN的情况下降低APPL1的表达，对于内源性小剂量APN的心肌保护作用影响不明显；② 内源性小剂量的APN可能通过AP⁃PL1以外的信号转导途径发挥了作用［15］；③ 这种情况下，可能还存在其他的内源性心肌保护分子代偿了小剂量APN作用的缺失。内源性的fAPN（全长APN）比gAPN（APN球状片段）浓度高很多，而在生理作用方面fAPN远不如gAPN［16］，这也是笔者外源性给予gAPN的原因。

再灌注前10 min给予较大剂量gAPN 2 μg／g腹腔注射显著减弱了小鼠MI／R损伤，超声心动图结果显示心脏功能得到改善（图2），伊文氏蓝／TTC染色结果显示心肌梗死面积显著减少（图3）。尽管在APPL1表达抑制组中，APN的心肌保护作用还部分存在（图2，3），但相对于无关对照SiRNA组，AP⁃PL1表达抑制组中APN的心肌保护作用明显降低（图2，3）。

本研究结果显示，在APPL1表达抑制的情况下，APN抗MI／R损伤作用减弱，表现为心脏LVEF的下降和心肌梗死面积的增加。由此可以推断，APPL1与AdipoR1的蛋白－蛋白相互作用很可能是APN在心肌细胞内转导的重要机制。对此，笔者将继续明确在急性MI／R损伤过程中，APPL1与AdipoR1蛋白－蛋白相互作用的变化，并探索APPL1参与调节APN抗MI／R损伤的信号转导途径。本研究为APPL1参与调控APN的抗MI／R损伤过程提供了理论依据，为进一步明确APN心肌保护的机制提供了新的思路，对于寻找心肌保护的新靶点有着重要意义。

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Effects of APPL1 knock－down on the cardioprotective actions of adiponectin a⁃gainst myocardial ischemia／reperfusion injury in mouse

Wang Zheng，Jin Zhen－xiao，Yi Wei，Yi Ding－hua
Department of Cardiovascular Surgery，Xijing Hospital，the Fourth Medical University，Xi＇an，710032，China Corresponding author：Yi Ding－hua，Email：yidh＠fmmu.edu.cn

Objective APPL1 is an important adiponectin receptor 1（AdipoR1）binding protein.The objective of this study is to investigate the effect of APPL1 expression inhibition on adiponectin（APN）＇s cardioprotective functions against myocardial ische⁃mia／reperfusion（MI／R）injury in a mouse model.Methods An in vivo MI／R mice model was used.The APPL1 expression was knocked down by intramyocardial injection of APPL1 specific stealth iRNA（APPL1 SiRNA，1ug／g）.Ten minutes before reperfusion，globular domain of APN（2 μg／g）or equivalent saline was given by intraperitoneal injection.The mice were randomly divided into 5 groups：Sham operation（Control），MI／R＋Scramble SiRNA，MI／R＋APPL1 SiRNA，MI／R＋Scramble SiRNA＋gAPN，and MI／R＋AP⁃PL1 SiRNA＋gAPN.The myocardial APPL1 expression was detected by Western Blot after 3 hours reperfusion（n＝6）.Cardiac function was determined by echocardiography and myocardial infarction（MI）size was determined by the Evans blue／TTC double staining meth⁃od after 24 hours reperfusion（n＝8）.Results Compared with Control and Scramble SiRNA group，the myocardial APPL1 expressions were significantly reduced in APPL1 SiRNA group（P＜0.01）.The LVEFs and MI sizes had no significant difference between MI／R＋Scramble SiRNA group and MI／R＋APPL1 SiRNA group.Compared to MI／R＋Scramble SiRNA group，MI／R＋Scramble SiRNA＋gAPN group and MI／R＋APPL1 SiRNA＋gAPN group had better LVEFs（P＜0.01），and the MI sizes were obviously reduced（P＜0.01）.Compared to MI／R＋Scramble SiRNA＋gAPN group，MI／R＋APPL1 SiRNA＋gAPN group had much decreased LVEFs（P＜0.01），and the MI sizes were obviously increased（P＜0.01）.Conclusion The inhibition of myocardial APPL1 expression largely diminishes the cardioprotective actions of APN against MI／R injury in a mouse in vivo model.

Cardioprotection；Adiponectin；Ischemia／reperfusion injury；APPL1

2014⁃03⁃11）

2014⁃03⁃20）

10.13498／j.cnki.chin.j.ecc.2014.02.15

国家自然科学基金（编号：81100137）

710032西安，第四军医大学第一附属医院心血管外科

易定华，Email：yidh＠fmmu.edu.cn