富硒绿茶对大鼠非酒精性脂肪肝Ca2+-ATPase活性和表达的影响

王凤杰，陈显兵,*，张书毓，谭志鑫，向国敏，刘锦红

（1.湖北民族学院 生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院科技学院，湖北 恩施 445000）

富硒绿茶对大鼠非酒精性脂肪肝Ca2+-ATPase活性和表达的影响

王凤杰1,2，陈显兵1,2,*，张书毓2，谭志鑫2，向国敏2，刘锦红2

（1.湖北民族学院 生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院科技学院，湖北 恩施 445000）

目的：研究恩施富硒绿茶对大鼠非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）中肝脏肌浆网/内质网Ca2+-ATPase（sarco（endo）plasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA）活性及其表达的影响，探讨富硒绿茶防治NAFLD的可能作用机制。方法：将32 只Wistar大鼠分成4 组，分别饲喂标准饲料+常规饮水（NC组）、高脂饲料+常规饮水（HC组）、高脂饲料+普通绿茶（TC组）、高脂饲料+富硒绿茶（SeC组）。9 周后处死，观察大鼠一般情况，测定肝细胞内Ca2+含量、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平、肝脏组织ATPase活性；采用免疫组化染色和Western blotting检测肝脏内总SERCA蛋白表达，观察各指标变化情况。结果：HC组大鼠肝细胞内Ca2+含量明显增高，Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性降低，SERCA蛋白表达降低；富硒绿茶干预后Ca2+含量降低，酶活性升高，表达增加，较普通绿茶效果明显。结论：富硒绿茶对高脂饮食诱导的大鼠非酒精性脂肪肝病具有干预作用，可能是通过降低肝细胞内Ca2+和TNF-α含量而改善肝脏能量代谢障碍，同时提高了SERCA活性，增强其蛋白表达而实现的。

富硒绿茶；非酒精性脂肪肝病；肌浆网/内质网Ca2+-ATPase

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）已愈来愈成为全球关注的健康问题，由内质网结构和功能异常导致的内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）和脂质代谢障碍是研究热点之一。Ca2+广泛分布于细胞质、细胞核、内质网、高尔基体等部位，在细胞分化、凋亡、免疫等多方面发挥重要作用[1]，肌浆网/内质网Ca2+-ATPase（sarco（endo）plasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA）是ATP依赖性的Ca2+转运酶，主要分布在内质网和肌浆网膜上。细胞内氧化应激可以破坏内质网稳态，启动Ca从内质网Ca池的释放，增加活性氧的产生，进而放大氧化应激及Ca负载，引起恶性循环。前期研究已证实NAFLD大鼠肝脏内抗氧化酶活性降低，脂质过氧化反应增强，提示氧化应激和脂质过氧化反应可能参与了NAFLD的发生[2]，而且富硒绿茶具有降低脂肪肝形成、清除自由基、提高抗氧化酶活性、抑制脂质过氧化反应等功效[2-3]。那么富硒绿茶在预防和治疗NAFLD的发生发展过程中的机制是怎样的呢？本实验通过高脂饮食诱导NAFLD大鼠模型，观察富硒绿茶干预后脂肪肝的氧化性损伤及SERCA活性及表达情况，探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

Wistar大鼠32 只，由湖北省实验动物研究中心提供（生产许可证号：SCXK（鄂）2008-0005；使用许可证号：SYXK（鄂）2008-0014），雌雄各半，体质量180～200 g。

富硒绿茶为恩施富硒区宣恩伍家台贡茶，采用示波极谱法检测出富硒绿茶的硒含量为3.235 8 μg/g，武汉某普通绿茶硒含量为0.428 57 μg/g。饲料由湖北省实验动物研究中心提供，高脂饲料配方如下（以下均为质量分数）：标准饲料80%，猪油10%，蛋黄粉10%[4]。

胆固醇 武汉化学试剂公司；ATPase测定试剂盒、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫试剂盒 南京建成生物工程研究所；SERCA抗体 美国Santa Cruz公司；内参β-actin（1∶2 000）美国Sigma公司；BCA蛋白定量试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

5418型离心机 德国Eppendorf公司；UV-5300紫外-可见分光光度计 西安德派生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组及模型建立

Wistar大鼠32 只，常规喂养1 周后分为4 组，每组8 只。正常对照组（NC组）、高脂模型组（HC组）、普通绿茶组（TC组）及富硒绿茶组（SeC组）；NC组喂标准饲料，HC、TC及SeC组喂高脂饲料，均自由饮水，在此基础上，NC和HC 2 组均用蒸馏水（3 mL/d）灌胃作为对照；2 种绿茶分别加沸蒸馏水配成质量分数10%茶溶液，TC组用普通绿茶溶液灌胃（1.5 g/（kg·d）），SeC组灌胃富硒绿茶溶液（1.5 g/（kg·d））。按上述要求持续喂养9 周后处死，进行各项指标检测。

1.3.2 观察指标及测定分析方法

1.3.2.1 肝脏组织病理学检测

取肝脏组织用质量分数10%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，常规苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察肝脏脂肪变性、炎细胞浸润及纤维化程度。

免疫组化染色：采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化法（immunohistochemistry，IHC）检测，二氨基联苯胺显色，一抗SERCA的工作浓度为1∶800，操作流程按试剂说明书进行。

Western blotting检测肝脏组织内SERCA1/2/3蛋白的表达：取-80 ℃保存的肝脏组织加入到10 倍体积pH 7.4的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中，用电动匀浆器制备肝匀浆，4 ℃、12 000 r/min 离心20 min后，取上清液进行蛋白定量后检测。图像扫描和分析采用美国UVP公司凝胶成像系统及分析软件。

1.3.2.2 肝细胞中Ca2+含量的测定

采用火焰原子吸收法测定细胞内Ca2+含量[5]。

1.3.2.3 肝脏组织TNF-α水平测定

采用酶联免疫法按照试剂盒说明测定肝匀浆中TNF-α含量。

1.3.2.4 肝脏组织Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性测定

采用定磷法测定，按试剂盒说明书操作。ATPase活性以每小时每毫克组织蛋白中ATPase分解ATP产生1 μmol无机磷的量作为一个ATPase活力单位/（μmol/（mg·h））。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 肝脏组织病理学改变

2.1.1 常规HE染色

参照前期研究结果[2]，证实HC组大鼠肝质量及肝指数最大，肝小叶内可见明显的大泡样脂肪变性，弥漫分布，另见少量炎细胞浸润，脂肪变性程度显著强于其他组，说明造模成功。

2.1.2 免疫组化染色

图1 大鼠肝脏中SERCA1/2/3蛋白定位表达（IHC，×400）Fig.1 Expression of SERCA1/2/3 in liver (IHC, ×400)

喂养结束后取各组大鼠部分肝脏组织做免疫组化染色，检测肝脏内SERCA蛋白表达情况。如图1所示，SERCA蛋白表达主要位于肝细胞胞浆内，NC组SERCA蛋白呈棕黄色细颗粒状，均匀分布；HC组阳性细胞数明显减少，着色强度减弱，且胞浆内可见脂肪空泡；TC组肝小叶中央静脉周围可见少量阳性细胞；而经富硒绿茶干预后的SeC组肝细胞内可见棕黄色阳性细胞量增多，弥漫分布，染色强度亦增加，说明蛋白表达增强。

2.1.3 Western blotting检测蛋白表达情况

图2 肝脏SERCA1/2/3蛋白表达Fig.2 Expression of SERCA1/2/3 in liver

由图2可知，各组大鼠肝脏内均可见SERCA蛋白表达，但蛋白条带灰度值有差异，重复实验3 次以上结果做统计学分析（图2b），HC组大鼠肝脏内蛋白量极显著低于NC组（P＜0.01）；SeC组较HC组蛋白表达量显著增加（P＜0.05）；而TC组与HC组相比差异无统计学意义，说明饮用普通绿茶水在增加肝脏组织SERCA蛋白表达量上无明显作用。

2.2 肝脏内Ca2+、TNF-α含量变化

表1 肝脏内Ca2+、TNF- 含量变化（x ＝8）Table1 Ca2+ and TNF- levels in liver (x , = 8)

由表1可知，与NC组相比，HC组肝细胞内Ca2+含量明显升高，而TC组和SeC组经干预后Ca2+含量均降低，差异显著（P＜0.05），SeC组作用更明显（P＜0.05）；HC组肝脏组织内TNF-α水平明显高于NC组，富硒绿茶干预后其含量降低，效果优于TC组（P＜0.05）。说明富硒绿茶在降低肝脏内Ca2+含量及改善肝损伤方面较普通绿茶效果更明显。

2.3 肝脏组织Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性的变化

表2 肝脏组织内Na -K -ATPase、Ca2+-ATPase活性变化（x ＝8）Table2 Activities of Na -K -ATPase and Ca2+-ATPase in liver (x , = 8)

由表2可知，HC组大鼠肝脏Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性下降，富硒绿茶干预后，SeC组2 种酶活性均明显升高，差异极显著（P＜0.05）；而且与普通绿茶相比，富硒绿茶更能提高Ca2+-ATPase活性（P＜0.05）。

3 讨 论

NAFLD目前已成为导致无症状性转氨酶升高的首要病因[6]，后期可进展为肝硬化。外源性高脂饮食使血清游离脂肪酸（nonestesterified fatty acid，NEFA）增加，肝脏对NEFA摄取的增加使线粒体β氧化速度代偿性增加，进而增加反应性氧产物的产出，反应性氧产物与膜磷脂的不饱和脂肪酸反应形成脂质过氧化，而且随着脂质过氧化反应的加剧，肝细胞形态和功能的损伤程度加重[7]，当活性氧化的产生超过体内抗氧化系统的清除能力时，便产生氧化应激导致脂质过氧化损伤，使枯否细胞激活并释放肿瘤坏死因子等炎性细胞因子和递质，引起脂肪性肝炎甚至肝硬化[8-9]。本课题组前期通过高脂饮食已经成功诱导出NAFLD模型，模型组大鼠体质量及肝脏质量明显增加，血脂及肝脏脂肪化程度均明显增高，富硒绿茶干预后能有效降低高脂饮食诱导的大鼠肝脏脂肪变性程度[2]，亦证实氧化应激、脂质过氧化与NAFLD的发病存在某种联系，这与国内外某些文献报道一致[10]。

线粒体功能明显异常，既是NAFLD的结果也是导致进一步损伤的重要环节[11]。脂肪肝病时由于ATP生成减少，Na+-K+-ATPase活性降低可导致肝细胞损伤[12]。Ca2+-ATPase是维持细胞内Ca平衡的重要物质，其活性下降使线粒体Ca泵向细胞外排Ca作用减弱，线粒体内Ca超载是线粒体氧化磷酸化障碍、结构受损和细胞坏死的重要原因[13]。SERCA能够逆浓度梯度将细胞质中的Ca2+转运至内质网中从而降低细胞质中的Ca2+浓度，这对于Ca信号和细胞增殖具有重要的作用[14]。SERCA有3 种亚型，不同组织和种属存在不同亚型，大鼠肝脏表达SERCA 2b和SERCA 3两种亚型[15-16]。本实验发现NAFLD大鼠肝脏组织中Ca2+-ATPase和Na+-K+-ATPase活性及蛋白表达均显著下降，Ca含量明显升高，出现Ca超载现象，这可能与氧自由基产生增加，导致膜脂质过氧化，使膜通透性改变，细胞外Ca2+内流，同时细胞Ca2+-ATPase失活，胞内Ca外流障碍，Na+-K+-ATPase失活，胞内Na+含量增加，刺激Na+-Ca2+交换，使Ca2+内流增加，加剧了Ca超载。富硒绿茶干预可以明显提高NAFLD大鼠肝脏组织中谷胱甘肽过氧化物酶[2]、Ca2+-ATPase和Na+-K+-ATPase活性，增强总SERCA蛋白表达，有效阻抑丙二醛[2]和Ca2+含量的升高。另外，发生脂肪肝时肝脏内TNF-α水平明显增高，提示可能存在肝损伤及炎症反应，通过肝脏组织病理学检查也证明存在炎症及肝细胞坏死；也有研究表明TNF-α可以通过增强自由基的产生和脂质过氧化等方面促进脂肪性肝炎的发生[17-18]，富硒绿茶干预后TNF-α水平降低，且比普通绿茶效果更加明显。富硒绿茶保护肝损伤的机制可能是茶多酚增强脂肪肝大鼠自由基代谢作用，对ATPase活性下降和组织Ca超载有阻抑作用。因为天然抗氧化剂茶多酚是从茶叶中提取的一种多酚类物质，结构中富含酚羟基，可提供活泼氢使自由基灭活，而本身被氧化形成的自由基由于含邻苯二酚结构而具有较高稳定性，具有抗氧化、保护生物膜及调节组织Ca2+含量等广泛的生物学作用，研究证实其抗氧化效果比VE、VC高出20 倍[19]；也可能是硒作用所致，王玉珍等[20]认为硒可以增加细胞膜、肌浆网Ca泵的活性，防止细胞内Ca2+超载；缺硒也可能通过过氧化损伤导致细胞内Ca2+超载[21]。由此推测富硒绿茶可能是通过降低脂肪肝病大鼠肝脏内Ca2+含量、维持细胞内Ca稳态、降低肝细胞炎症反应、提高Ca2+-ATPase活性、增强肝脏总SERCA表达，进而改善大鼠肝脏能量代谢障碍，达到干预NAFLD发生发展的目的。

SERCA表达情况还和细胞的种类、生长状态等均有关，而且SERCA的活性不仅和表达量有关，还受机体代谢等方面的影响。那么在NAFLD中氧自由基的堆积、Ca2+超载与SERCA表达之间的关系及有无相互作用，以及调控机制如何，还有待进一步实验研究。

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Effect of Selenium-Enriched Green Tea on Activity and Expression of Sarco(endo)Plasmic Reticulum Ca2+-ATPase
(SERCA) in Rats with Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD)

WANG Feng-jie1,2, CHEN Xian-bing1,2,*, ZHANG Shu-yu2, TAN Zhi-xin2, XIANG Guo-min2, LIU Jin-hong2
(1. Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province, Hubei Minzu University, Enshi 445000, China; 2. Science and Technology College of Hubei Minzu University, Enshi 445000, China)

Objective: To investigate the effect of selenium-enriched green tea on the activity and expression of sarco(endo) plasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) on model rats with experimental non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and explore the possible mechanisms for the prevention and treatment of NAFLD. Methods: Totally 32 Wistar rats were divided into 4 groups randomly and fed with standard diet and water (NC), high-fat diet and water (HC), high-fat diet and tea (TC), high-fat diet and selenium-enriched tea (SeC), respectively. After 9 weeks, the rats were killed to investigate the changes in Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase activities. Meanwhile, hepatic tumor necrosis factor-α (TNF-α) and Ca2+levels and the protein expression of SERCA in hepatocytes was evaluated by immunohistochemistry (IHC) and Western blotting. Results: The protein expression of SERCA and the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase were significantly decreased and the Ca2+level was remarkably increased in HC group. The activity and expression of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase in liver were markedly upregulated in intervention group. On the contrary, the level of Ca2+in SeC group was greatly reduced when compared with ordinary tea. Conclusion: Selenium-enriched green tea can improve hepatic energy metabolism disorder, protect liver function, and prevent liver damage in NAFLD rats.

selenium-enriched green tea; nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD); sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA)

R285.5

A

1002-6630（2014）21-0219-04

10.7506/spkx1002-6630-201421043

2014-01-22

生物资源保护与利用湖北省重点实验室项目（PKLHB1308）；湖北民族学院科技学院科研项目（KY201410）

王凤杰（1981—），女，讲师，硕士，研究方向为微量元素与健康。E-mail：625958220@qq.com

*通信作者：陈显兵（1976—），男，副教授，硕士，研究方向为微量元素与健康。E-mail：chenxianbing7612@163.com