超高压处理对僵直前獭兔肉品质及微观结构的影响

王稳航，徐倩倩，刘 婷，鲁冬雪，李 茜，赵文萍

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

超高压处理对僵直前獭兔肉品质及微观结构的影响

王稳航，徐倩倩，刘 婷，鲁冬雪，李 茜，赵文萍

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

以僵直前獭兔肉为原料，在室温（25 ℃）条件下，分别用100、200、400 MPa超高压处理15 min，-8 ℃贮存24 h，然后对兔肉进行品质分析和超微结构研究。结果表明：随着压力的升高，兔肉亮度（L*）值升高，红度（a*）值降低，兔肉颜色由浅红色逐渐变为灰白；随着压力的升高兔肉蒸煮损失率、滴水损失率呈现先下降后上升的趋势，在200 MPa时兔肉的蒸煮损失率、滴水损失率最低，分别为31.54%和2.61%；超高压对兔肉嫩度影响显著（P＜0.05），在0.1～200 MPa之间，剪切力随压力增大而降低，而400 MPa处理时，兔肉剪切力急剧升高并显著高于对照组（0.1 MPa）；100 MPa压力处理，兔肉组织结构与对照组相比变化不大，而400 MPa时兔肌肉显微组织结构变化明显：肌节收缩，肌纤维歪曲、片段化，蛋白质发生解聚、三级结构遭到破坏。可见，不同的超高压对僵直前獭兔肉的品质和微观结构有显著影响，且200 MPa是最适于僵直前兔肉处理的超高压条件。

超高压；僵直前；兔肉；品质；微观结构

随着社会的发展，人们对肉制品种类的要求越来越多，对肉制品安全、营养的要求也越来越高。超高压技术（ultra high pressure，UHP）作为一种新兴的物理处理技术，在肉制品中的应用受到广泛的关注[1]。食品超高压技术是将食品原料密封包装后，利用100 MPa及以上的静水压力（常用的压力范围为100～1 000 MPa），在常温或一定温度下处理食品一定时间，从而引起食品成分、非共价键（氢键、离子键和疏水键等）的破坏或形成，使食品中的蛋白质、酶、淀粉等生物高分子物质分别失活、变性和糊化，并杀死食品中的微生物，从而达到食品灭菌保藏和加工的目的[2-3]。

超高压技术在肉品加工中的应用主要目的是改善肉品品质[4]。超高压对肉类品质的改善主要包括：提高肉的嫩度[5]、改善肉的颜色[6]、增加肉的凝胶性和乳化性[7]、杀死肉中的细菌、延长肉制品的保质期[8]等。此外超高压还能改变肌肉的微观结构，使肌动球蛋白在压力作用条件下解聚。Macfarlane等[9]研究发现150 MPa的超高压处理条件可以提高羊肉肌纤维蛋白的溶解性。有研究证明鲜肉在僵直前进行100～200 MPa的超高压处理对肉质嫩化有显著效果；而对僵直发生后的肉进行100～200 MPa超高压处理，在温度低于30 ℃时其剪切力、嫩度和多汁性都没有改善[4]。随着超高压技术的发展，其在肉制品加工中应用也越来越广泛，但是超高压对肉品质的研究主要集中在牛肉、羊肉、猪肉等几种肉类[10-12]，对兔肉品质影响的研究却十分鲜见。

我国是世界上最大的兔肉生产、出口国，兔肉由于具有高蛋白、高赖氨酸、高消化率、高磷脂、低热量、低脂肪、低胆固醇等特点[13]，深受消费者喜爱。近年来，国内外学者在兔肉肉质特性方面开展了大量的研究，研究结果揭示了兔肉独特的加工品质和营养价值[14]。本实验以僵直前獭兔作为研究对象，通过不同压力超高压处理各组样品，研究超高压对僵直前獭兔肉品质的影响，旨在为超高压在兔肉加工方面的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

獭兔 天津动物所实验研究中心。

考马斯亮蓝（分析纯） 上海科星实验室设备有限公司；苏木精（分析纯） 美国Amreso公司；丙烯酰胺（分析纯）、三羟甲基氨基甲烷（Tris，分析纯）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS，化学纯）北京索莱宝公司；戊二醛、冰醋酸、无水乙醇、氯化钠（均为分析纯） 天津市江天化工技术有限公司；标准分子质量蛋白 北京康为世纪试剂公司；伊红（优级纯） 上海三爱思有限公司。

1.2 仪器与设备

HPP-L3型超高压设备 天津市华泰森淼生物技术有限公司；PHS-3C型pH计 上海理达仪器厂；ST40R冷冻离心机 美国Thermo Fisher科技有限公司；XSZ-H型生物显微镜 重庆光电仪器总公司；冷冻切片机（CM1900号） 德国Leica公司；SU1510SU1510型扫描电子显微镜 日本Hitacahi公司；CIE-LAB全自动色差计 日本Minolta公司；JY600C型电泳仪 北京君意东方电泳设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肉样制备与处理

獭兔购回后缓养12 h，屠宰前称质量。参考范成强等[15]的屠宰方法，应用头部电击（90 V，160 Hz）的方式将獭兔击晕，倒挂割脖放血，然后从后腿脚跟处开始剥皮。取兔肉，去除可见的结缔组织和脂肪，将兔肉放入聚乙烯塑料袋，排除袋内空气抽真空，将兔肉分为4 组进行超高压处理。分别为：0.1（对照组）、100、200、400 MPa，超高压在室温下进行，时间为15 min。此过程操作要迅速，在兔肉僵直前完成处理。迅速将处理后样品在-18 ℃保存24 h，然后在4 ℃冰箱中平衡12 h使兔肉解冻，将解冻后样品切为1 cm×1 cm×3 cm小块，进行相关指标测定。

1.3.2 色度测定

在测定样品肉的色度值前，先用黑板、白板校准色度计，然后把自封带套到白板上，测定CIE（色度值）作为参照。将装有肉的自封袋铺平，使其没有气泡和间隙，每个处理测3 组取平均值[16]。测定指标包括总色差值（ΔE）、亮度（L*）值、红度（a*）值、黄度（b*）值。

1.3.3 剪切力的测定

将数显温度计的温度探头插入肉的中心位置，扎紧袋口，然后置于80 ℃恒温水浴中加热，用温度计记录肉块中心温度的变化。参照徐舶等[17]的方法并略加调整，当肉中心温度达75 ℃时取出（大概时间为20 min），然后放入4 ℃冰箱冷却，使肌肉样品的中心温度降到4 ℃，采用Warner-Bratzler[18]的方法测定肌肉的剪切力，刀头平行于纹理切割，探头为HDP/BS；测前速率为1.5 mm/s；测定速率为1.5 mm/s；测后速率为10.0 mm/s；负载类型为Auto-40 g[19]。

1.3.4 pH值的测定

参考Chan等[20]的方法，将肌肉组织放入去离子水中，去离子水和肌肉组织质量比为9∶1，用组织匀浆机匀浆，用电子pH计测定肌肉组织匀浆的pH值。

1.3.5 滴水损失率和蒸煮损失率的测定

参照Fernández等[21]的方法，称肉样质量（m1），再将肌肉样品挂到有曲别针改造的小钩上，外面罩上塑料袋，用细绳将口封死，将小钩悬挂于4 ℃冰箱，24 h后取出，用吸水纸吸取表面水分后，称质量（m2）。按公式（1）计算滴水损失率。

参照Li Chunbao等[22]的方法，称肉样质量（m1），然后外面罩上塑料袋，将数显温度计的温度探头插入肉的中心位置，扎紧袋口，放入80 ℃的水浴锅，当中心温度达到75 ℃时，取出肉样，放入4 ℃冰箱过夜，用吸水纸吸取表面水分，称质量（m2）。按公式（2）计算蒸煮损失率。

1.3.6 兔肉盐溶蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）

按照Xiong Youling L.等[23]的方法提取兔肉盐溶蛋白，然后参考Chan等[20]的方法，将提取的盐溶蛋白溶解，取20 μL加入Eppendorf管中，加入5 μL 5倍样品浓度缓冲液，置于沸水浴中加热5 min。配制12%分离胶和5%浓缩胶，在恒压（80 V）条件下电泳，完成后关闭电源，取下胶块，然后用考马斯亮蓝 R-250染色1 h，再用醋酸-甲醇溶液（3∶2，V/V）进行脱色，直到背景清晰。

1.3.7 HE染色观察细胞形态的变化

用冷冻切片机将兔肉切片，按姚海嵩等[24]的方法对冷冻切片进行固定。然后配制醇溶性伊红溶液，Mayer苏木精A液及Mayer苏木精B液，按下列步骤染色：

切片后放入A液固定（30 s）→水洗（30 s）→放入B液固定（1 min）→放入苏木素（5 min）→水洗→1%盐酸分化（20 s）→水洗→放入1%的氨水（40 s）→水洗→伊红染色（5 min）→水洗→70%酒精（30 s）→80%酒精（30 s）→95%酒精Ⅰ（1 min）→95%酒精Ⅱ（1 min）→100%酒精脱水Ⅰ（3 min）→100%酒精脱水Ⅱ（3 min）→二甲苯透明Ⅰ（10 min）→二甲苯透明Ⅱ（10 min）→中性树胶封片。

制作好的组织切片在100 倍显微镜下观察并拍照。

1.3.8 兔肉组织结构的扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）观察

参照Sotelo等[25]的方法处理样品并加以调整。将样品用刀片切成3 mm×3 mm×l mm小片，放入2.5%的戊二醛溶液中于4 ℃固定2 h，倒掉固定液，用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3 次，每次15 min。再放入1%锇酸后固定1.5 h。用体积分数为25%、50%、75%、90%和95%的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每个体积分数处理15 min，再用无水乙醇处理两次，每次20 min。再进行醋酸异戊醇梯度置换出乙醇后，将样品置于冷冻真空干燥机中冻干，经真空离子溅射镀金膜（20 nm左右）处理好的样品用于扫描电镜观察。

1.4 统计分析

2 结果与分析

2.1 超高压对兔肉色度的影响

表1 不同超高压处理对兔肉色泽的影响Table1 Effect of UHP on rabbit meat color

由表1的ΔE可以看出，不同的压力处理后，兔肉的色泽发生明显的变化。实验中观察到：室温下，僵直前超高压处理的兔肉的色泽随着压力的升高由浅粉色逐渐变为灰白色，当压力升高到400 MPa时变成灰色。兔肉L*值随着压力的增加而增大，100 MPa处理兔肉L*值与对照组相比差异不显著，而200、400 MPa处理的兔肉L*值显著大于对照组（P＜0.05）。兔肉a*值随着压力的增加而逐渐减小，100 MPa处理的兔肉a*值与与对照组相比差异不显著，而200、400 MPa处理的兔肉a*值则显著减小（P＜0.05）。这与马汉军等[26-27]的实验结果基本相符。

Willems等[28]在研究超高压对牛肉色泽的影响时提出牛肉经超高压处理后表面亮度值的增加可能是由于肌球蛋白变性和亚铁血红素被取代或释放，或使卟啉环被破坏和蛋白聚合；压力超过400 MPa时失去红色（a*值显著减小）是由于肌红蛋白在400 MPa超高压下发生变性，亚铁肌红蛋白氧化而变成高铁肌红蛋白。

2.2 超高压对兔肉嫩度的影响

图1 超高压处理对兔肉剪切力的影响Fig.1 Effect of UHP on the shear force of rabbit meat

由图1可知，4 组超高压处理下兔肉剪切力平均值分别为3.20、2.52、2.21、3.47 kg。在0.1～200 MPa内兔肉的剪切力随着压力的增大而降低，在400 MPa时剪切力却显著增大，200 MPa的超高压处理兔肉剪切力最小，可以有效的改善兔肉的嫩度，该结果与张秋勤等[29]的研究结论相一致。

2.3 超高压对屠宰24 h后兔肉pH值的影响

图2 不同超高压处理对屠宰24 h后pH值的影响Fig.2 UHP effects on the pH of Rex rabbit meat at 24 h postmortem

由图2可知，屠宰24 h后兔肉的pH值随压力升高而增大，200 MPa和400 MPa压力处理后兔肉pH值显著高于对照组（P＜0.05）。这与Angsupanich[30]和Sikes[31]等的结果基本一致。超高压处理后pH值的上升一方面是由于肌肉组织结构遭到破坏，使其内部的碱溶性物质外渗或碱性基团暴露出来，与酸性基团或酸性物质发生中和反应；另一方面超高压处理可能会使肌原纤维的肌浆网破裂，释放出大量Ca2+，激活钙激活中性蛋白酶，降解部分肌原纤维蛋白，使酸性基团减少[32]。pH值的变化会影响钙激活中性蛋白酶活性及蛋白质空间结构，从而影响兔肉的嫩度和保水性。

2.4 超高压对蒸煮损失率和滴水损失率的影响

图3 不同超高压条件下样品的蒸煮损失率（a）和滴水损失率（b）变化Fig.3 Changes in cooking loss rate (a) and drip loss rate (b) of rabbit meat treated with different UHPs

由图3可知，随着压力的增大兔肉的滴水损失率和蒸煮损失率均呈现先下降后上升的趋势。4 组超高压处理后兔肉的蒸煮损失率和滴水损失率分别为：35.96%、32.23%、31.54%、38.98%和2.98%、2.65%、2.61%、3.82%。100、200 MPa处理组的滴水损失率和蒸煮损失率显著小于对照组（P＜0.05），且两组之间无显著性差异（P＞0.05），保水性良好；400 MPa处理组的滴水损失率和蒸煮损失率显著大于其他处理组（P＜0.05），保水性最差。这可能是因为100、200 MPa两组超高压处理使蛋白质解聚，促使肌纤维蛋白溶解度增加，从而提高了肉品的保水性，而400 MPa则使肌纤维结构变得疏松，因而会使得肉中部分汁液流出，从而使其保水性急剧下降。由于蒸煮损失和滴水损失的减少，相应得率的增加，说明200 MPa超高压对提高肉制品出品率效果显著。

2.5 超高压处理对兔肉盐溶蛋白质的影响

标准分子质量蛋白包括兔磷酸化酶B（97.4 kD）、和兔肌动蛋白（45 kD）、组织相容性复合体（135 kD）等。由图4可知，随着压力的增大，在100、200 MPa时肌动蛋白分子条带与对照组相比略微变浅，但变化不大，在400 MPa时，肌动蛋白条带消失；肌球蛋白分子重链和两条轻链均逐渐变淡，在压力400 MPa时最浅。Angsupanich等[30]对超高压处理的鳕鱼肉进行差示扫描量热分析显示，400 MPa高压处理能使肌动蛋白和大部分的肌浆蛋白变性，而肌球蛋白在200 MPa就已经完全变性； 由Lakshmanan等[33]对鲑鱼蛋白水解酶的研究也可得出超高压处理过程中压力大小的不同会对蛋白质结构产生不同的影响，当压力较小时，低聚蛋白质的结构易发生解离，当压力为200 MPa时，蛋白质易发生解离，当压力为400 MPa时，部分蛋白亚基易发生凝聚。一般情况下，超高压压力为100～200 MPa时，蛋白质变化可逆，当压力大于300 MPa时，蛋白质的三级结构遭到了破坏，发生不可逆变性[33]。

图4 不同超高压条件下兔肉盐溶蛋白电泳图Fig.4 Electrophoretogram of salt-soluble proteins in rabbit meat treated with different UHPs

2.6 光学显微镜观察兔肌纤维变化

图5 横切肌纤维的HE染色结果Fig.5 HE-stained transverse sections of skeletal muscles

图6 纵切肌纤维的HE染色结果Fig.6 HE-stained longitudinal sections of skeletal muscles

由图5、6可以清楚地观察到随着压力的增加肌纤维结构逐渐发生变化的过程。0.1 MPa处理组的肌纤维排列整齐、连贯；200 MPa处理组的肌纤维歪曲并出现部分片段化；400 MPa处理组的肌纤维几乎完全片段化。超高压处理对肉的嫩化机理主要有以下两个方面：一是机械力的作用使肌肉纤维收缩和肌纤维蛋白解离成小片段，造成肌肉剪切力下降；二是压力处理使肌肉中内源蛋白酶钙激活酶的活性增加，加速了肌肉蛋白水解，加快肌肉成熟所致[34]。当压力达到200 MPa时，肌细胞膜遭到破坏，使Ca2+离子释放，激活钙蛋白酶水解蛋白质，导致肌肉嫩化；当压力增加到400 MPa时，ATP酶、钙激活酶系统和组织蛋白酶等与肉嫩化有关的酶的失活，故在此压力下肉的剪切力反而升高[35]。

从图5、6兔肉染色图片观察到随压力增大，红色部分减少，鲜兔肉的色泽随处理压力的升高而变浅，汁液溶出量增大，高压处理使肌纤维收缩。这是因为高压激活了肌肉中的ATP酶，ATP释放能量使肌动蛋白和肌球蛋白结合成肌动球蛋白从而导致肌纤维收缩[36]。

2.7 扫描电镜下观察肌纤维变化

图7 纵切肌纤维的扫描电镜观察结果Fig.7 Scanning electron micrographs of longitudinal sections of skeletal muscles

由图7可知，不同超高压条件处理下的兔肉的微观结构差异很大。常压（0.1 MPa）下的样品肌纤维呈现完整、有序的排列；在100 MPa处理组中，肌纤维弯曲，排列更加紧凑；使用200 MPa的压力处理时，肌纤维断裂，聚集在一起；当施加400 MPa压力时，兔肉结构的空间间隙明显因受压而挤在一起，兔肉组织肌原纤维间隙消失，蛋白质胶凝化现象严重，兔肉组织纤维状结构变成网状结构，表明400 MPa 的压力处理有利于良好凝胶的形成。郑捷等[37]研究了超高压处理对海鲈鱼肉凝胶形成的影响，结果表明用400 MPa高压处理时，蛋白质分子的二硫键会发生部分的断裂，巯基含量有所上升，使体系中氢键和疏水交联以及二硫键的比例变化，因此使超高压对蛋白质的凝胶特性起到改善作用。

3 结 论

超高压处理能够使僵直前獭兔肉品质和微观结构发生显著变化。适当的超高压（200 MPa）对肉的嫩度、保水性、色度均有改善作用。同时，从SEM图和HE染色结果可以看出超高压处理能使兔肌肉肌节收缩、肌纤维片段化、蛋白质发生解聚。超高压技术能开发出外观和质地不同的新型肉类食品，在肉品加工及贮藏中超高压技术具有多方面的优势，有很大的开发潜能。

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Effects of Ultra High Pressure on the Quality and Ultrastructure of Pre-rigor Rex Rabbit Meat

WANG Wen-hang, XU Qian-qian, LIU Ting, LU Dong-xue, LI Qian, ZHAO Wen-ping
(School of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Pre-rigor Rex rabbit meat was subjected to high pressure processing at 100, 200 and 400 MPa, respectively, at 25 ℃ for 15 min prior to storage at -18 ℃ for 24 h. The quality and ultrastructure of the rabbit meat were studied. With increasing pressure, L* increased, a* decreased and the reddish meat turned gray. Furthermore, cooking loss rate and drop loss rate showed an upward trend after the fi rst drop. The lowest drip loss and cooking loss (31.54% and 2.61%, respectively) were observed for rabbit meat when treated with 200 MPa. Ultra high pressure (UHP) had a signif i cant effect on the tenderness of rabbit meat (P ＜ 0.05). The shear force declined as the pressure increased from 0.1 to 200 MPa, but sharply increased at 400 MPa to be signif i cantly higher than that of the control group (0.1 MPa). There were only little changes in the organizational structure of the meat treaded with 100 MPa as compared to that of the control group (0.1 MPa). However, UHP processing at 400 MPa signif i cantly altered the microstructure of rabbit meat: sarcomere contraction, muscle fi ber distortion and fragmentation, protein depolymerization and tertiary structure were all destroyed. These results showed that ultra -high pressure causes signif i cant effects on the quality and ultrastructure of pre-rigor Rex rabbit meat and that the best ultra-high pressure condition for pre-rigor rabbit meat is 200 MPa.

ultra high pressure (UHP); pre-rigor; rabbit meat; quality; ultrastructure

TS251.5

A

1002-6630（2014）21-0073-06

10.7506/spkx1002-6630-201421015

2013-12-17

公益性行业（农业）科研专项（201303082）

王稳航（1977—），男，副研究员，博士，研究方向为动物源性食品加工与控制、食品大分子结构、性质与功能。E-mail：wangwenhang@tust.edu.cn