采后柠檬酸处理对苹果青霉病的控制及其贮藏品质的影响

葛永红，李灿婴，朱丹实，李颖琦，刘 婧

（1.渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁 锦州 121013；2.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）

采后柠檬酸处理对苹果青霉病的控制及其贮藏品质的影响

葛永红1，李灿婴1，朱丹实1，李颖琦2，刘 婧2

（1.渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁 锦州 121013；2.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）

以苹果为原料，研究不同质量分数柠檬酸常温浸泡处理对损伤接种扩展青霉（Penicillium expansum）果实病斑扩展的抑制效果及贮藏品质的影响。结果表明：离体条件下柠檬酸能够抑制P. expansum的孢子萌发，其中以1%质量分数效果最佳，1%柠檬酸处理显著降低了损伤接种苹果果实P. expansum病斑直径；柠檬酸处理显著提高了果实过氧化物酶、过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶活性。此外，柠檬酸处理还有效延缓了果实质量损失率的升高，抑制果实硬度、抗坏血酸含量、可滴定酸和可溶性固形物质量分数的下降，且推迟了果实呼吸高峰的出现。

柠檬酸；苹果果实；品质；采后

苹果（Malus domestica Borkh）属跃变型果实，在采后贮藏、运输和销售过程中很容易腐烂变质，给生产者和经营者带来巨大的经济损失[1]。果实的品质劣变主要是由于水分蒸腾、果胶物质降解、呼吸消耗等所致，同时营养物质的消耗也在一定程度上降低了果实的抗病性。因此，延缓采后果实的衰老及病害控制是提高苹果品质及延长贮藏期的重要措施。贮运过程中由扩展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病是主要采后病害之一，目前最有效的方法还是依靠化学杀菌剂[2-3]。随着人们对食品安全性和环境污染的重视，化学杀菌剂在果实采后病害防治中的应用逐渐受到限制。采用安全、持续、广谱和无环境污染的采后防腐保鲜措施已成为当前的研究热点[4]。

柠檬酸是果实体内存在的一种重要有机酸，参与组织呼吸代谢等生理代谢过程，也是一种有效的非生物诱抗剂。已有研究报道，采后柠檬酸处理能够延缓蚕豆[5]、芒果[6]、鸭梨[7]、枣[8]等果实的衰老进程。采后柠檬酸处理抑制了马铃薯硫色镰刀菌（Fusarium sulphureum）引起的干腐病的发生[9]、甜瓜果实损伤接种互隔交链孢（Alternaria alternata）的病斑扩展[10]。进一步研究表明柠檬酸处理提高果实抗病性与提高果实β-1,3-葡聚糖酶、过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶活性，促进类黄酮、酚类和木质素等抗性物质的显著积累密切相关[9-10]。有关柠檬酸处理对苹果青霉病的控制及贮藏品质的影响尚未见报道。

本实验以苹果为原料，研究采后柠檬酸处理对P. expansum孢子萌发及损伤接种P. expansum果实病斑扩展的影响，探索柠檬酸处理对果实抗氧化酶活性及贮藏品质的影响，以期为柠檬酸在果蔬贮藏保鲜中的进一步应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试青冠苹果果实2013年8月采自甘肃省景泰条山农场，在八成熟时采收，单果套发泡网袋后纸箱包装当天运回实验室常温贮藏待用（温度（20±2）℃，相对湿度45%）。供试P. expansum分离自自然发病的苹果果实，纯化后在马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基上培养待用。

PDA培养基配方：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂20 g，溶解于1 000 mL蒸馏水中。

柠檬酸（分析纯） 天津永晟精细化工有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-2450型分光光度计 日本岛津公司；H-1850R型离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；GY-1型水果硬度计 杭州托普仪器有限公司；WYT-32型阿贝折光仪 厦门中村光学仪器厂；GXH-3051H型红外CO2果蔬呼吸测定仪 北京均方理化科技研究所。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

选择大小一致、无机械损伤和病虫害的果实，表面清洗后用质量分数1%、2%、4%柠檬酸溶液（含体积分数0.05%的吐温80）浸泡处理10 min，待晾干后包装常温贮藏待用（温度（20±2）℃，相对湿度45%）。用清水处理作对照（CK），每处理15 个果实，重复3 次。

1.3.2 孢子悬浮液的配制

参照Bi Yang等[11]方法。取25 ℃条件下培养7 d的带菌PDA平皿一个，加入含0.05%吐温80的无菌水约10 mL，用玻璃棒刮下PDA平板上的病原菌孢子，然后转入50 mL三角瓶中，在WYX-A微型旋涡混合器上振荡15 s，再用双层纱布过滤，滤液用血球计数板计数算出孢子悬浮液的孢子含量，最后稀释至所需含量（1×105个/mL）。

1.3.3 孢子萌发实验

将配制好的P. expansum孢子悬浮液加入到经灭菌的含有1%、2%、4%柠檬酸的马铃薯葡萄糖（potato dextrose，PD）培养基中，然后在25 ℃条件下培养，当对照孢子萌发数达到80%以上时，统计各处理孢子萌发数并计算孢子萌发率。

1.3.4 损伤接种

参照Bi Yang等[11]方法。各处理果实先经75%酒精表面消毒，然后用灭菌铁钉在果实赤道部位均匀刺孔4 个（深3 mm，直径3 mm），晾干后分别取20 μL含量为1×105个/mL的P. expansum孢子悬浮液接种于孔内，晾干后装箱用PE膜包装保湿，室温贮藏第4天开始，每隔1d观察发病率，并用十字交叉法测量病斑直径，筛选出最佳柠檬酸质量分数。

1.3.5 取样方法

分别于1%柠檬酸和清水处理后0、2、4、6、8 d用直径5 mm打孔器取皮下10～15 mm处果肉组织3 g，用锡箔纸包好，液氮冷冻后在-80 ℃低温冰箱中保存备用。

1.3.6 呼吸强度测定

用GXH-3051H型果蔬呼吸测定仪测定果实呼吸强度。取果实30 个，在果实贮藏第0、2、4、6、8天测定果实在12 min内的CO2产生量，呼吸强度以mL CO2/（kg·h）表示。

1.3.7 可溶性固形物含量和硬度测定

参照曹建康等[7]的方法。用阿贝折光仪和硬度计在果实贮藏第0、2、4、6、8天测定果肉可溶性固形物含量和硬度。每个果实测4 个点（阳面、阴面各两点），每处理用果实10 个，重复3 次。

1.3.8 可滴定酸和抗坏血酸含量测定

可滴定酸含量测定参照韩雅珊[12]方法并修改。10.0 g样品磨碎，用已煮沸、冷却的蒸馏水移入100 mL的容量瓶中定容，过滤。吸取滤液10 mL，加入2～3 滴1%酚酞指示剂，用标定后的0.01 mol/L NaOH溶液滴定。果实可滴定酸含量以苹果酸（换算系数为0.067）进行计算。

抗坏血酸含量测定参照任亚琳等[13]方法。3.0 g果肉组织加5 mL预冷的100 mmol/L盐酸充分研磨，在4 ℃、10 000×g条件下离心10 min，取上清液100 øL加入2 mL 100 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH 6.0）再加入0.5 mL蒸馏水在265 nm波长处测定其吸光度，并以抗坏血酸制作标准曲线。以每克鲜质量的抗坏血酸质量表示抗坏血酸含量。

1.3.9 质量损失率的测定

参照任邦来等[14]的方法并修改。称量法测量果实的质量，采用差量法计算。每处理10 个果实，重复3 次。

1.3.10 抗性酶活性测定

过氧化物酶（peroxidase，POD）活性的测定参照葛永红等[10]方法。酶活性以每分钟吸光度变化0.01为1 个活性单位（U），POD活性以U/g表示。

抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性测定参照Ren Yaling等[15]方法。以每分钟反应体系吸光度变化0.01定义为1 个酶活性单位（U），APX活性以U/g表示。

过氧化氢酶（catalase，CAT）活性测定参照Cao Jiankang等[16]方法。取3 g果肉，加入1 mL预冷pH 7.5的0.05 mol/L磷酸缓冲液（内含50 mmol/L二硫苏糖醇和1%交联聚乙烯吡咯烷酮）在冰浴中研成匀浆，12 000×g、4 ℃条件下离心20 min，收集上清液立即用于CAT酶活测定。CAT反应体系包括粗酶液100 μL和3 mL 20 mmol/L的H2O2，以蒸馏水作参比。在240 nm波长处测定2 min时的样品吸光度。CAT活性以U/g表示。

1.4 数据处理

实验数据用Microsoft Excel 2007计算标准误差并作图，SPSS V17.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 柠檬酸处理对P. expansum孢子萌发的影响

P. expansum在培养24 h后孢子大量萌发，对照萌发率达到90%，不同质量分数柠檬酸处理均抑制了孢子萌发，其中以1%和2%柠檬酸处理的孢子萌发率与对照有显著性差异，其中以1%柠檬酸处理的萌发率最低（图1）。

图1 柠檬酸处理对P. expansum孢子萌发的影响Fig.1 Effect of postharvest citric acid treatment on spore germination of P. expansum

图2 采后柠檬酸处理对损伤接种P. expansum苹果病斑直径的影响Fig.2 Effect of postharvest citric acid treatment on lesion diameter in apple fruits inoculated with P. expansum

2.2 柠檬酸处理对损伤接种P. expansum苹果果实病斑直径的影响随着贮藏时间的延长，接种苹果果实病斑直径逐渐增大，1%、2%和4%柠檬酸处理均降低了损伤接种苹果果实P. expansum病斑直径，其中只有1%柠檬酸与对照间有显著性差异，高含量的柠檬酸没有进一步抑制果实病斑扩展（图2）。

2.3 柠檬酸处理对苹果果实质量损失率的影响

图3 采后1 柠檬酸处理对常温贮藏期间苹果果实质量损失率的影响Fig.3 Effect of postharvest 1% citric acid treatment on weight loss in apple fruits during storage at room temperature

随着贮藏时间的延长，对照和处理苹果果实质量损失率逐渐增加，但1%柠檬酸处理果实的质量损失率明显低于对照，在贮藏4、6、8 d后显著低于对照，分别较对照组果实低43.6%、26.3%和39%（图3）。

2.4 柠檬酸处理对苹果果实呼吸强度的影响

图4 采后1 柠檬酸处理对常温贮藏期间苹果果实呼吸强度的影响Fig.4 Effect of postharvest 1% citric acid treatment on respiration intensity of apple fruits during storage at room temperature

苹果属于典型的呼吸跃变型果实，常温贮藏过程中果实呼吸强度先升高后下降，在贮藏第4天出现峰值，但1%柠檬酸处理推迟了呼吸高峰的出现（图4）。说明柠檬酸处理有利于延缓果实的衰老进程。

2.5 柠檬酸处理对苹果果实硬度和可溶性固形物质量分数的影响

整个常温贮藏期间，处理和对照组果实硬度均呈逐渐下降趋势，但柠檬酸处理明显延缓了果实硬度的下降速率（图5A）。果实可溶性固形物质量分数呈先升高后降低的趋势，柠檬酸处理组果实可溶性固形物质量分数在贮藏前期低于对照，贮藏6d后高于对照（图5B）。由此说明，柠檬酸处理在一定程度上延缓了果实可溶性固形物质量分数的下降。

2.6 柠檬酸处理对苹果果实可滴定酸质量分数和抗坏血酸含量的影响

图6 采后1 柠檬酸处理对常温贮藏期间苹果果实可滴定酸质量分数（A）和抗坏血酸含量（B）的影响Fig.6 Effect of postharvest 1% citric acid treatment on titratable acid (A) and ascorbic acid (B) contents in apple fruits during storage at room temperature

随着贮藏时间的延长，果实可滴定酸质量分数逐渐下降，柠檬酸处理果实可滴定酸质量分数高于对照果实，但差异不显著（图6A）。抗坏血酸含量随着贮藏时间的延长先降低后升高再降低趋势，柠檬酸处理显著维持了高水平的抗坏血酸，并且在第贮藏第6天出现峰值，高出对照36.5%（图6B）。

2.7 柠檬酸处理对苹果果实抗性酶活性的影响

图7 采后1 柠檬酸处理对苹果果实POD（A）、CAT（B）和APX（C）活性的影响Fig.7 Effect of postharvest 1% citric acid treatment on POD (A), CAT (B) and APX (C) activities in apple fruits

整个贮藏期间，对照和处理果实POD活性呈先升高后降低趋势，但柠檬酸处理显著提高了苹果果实POD活性，其中在贮藏第4天和第6天差异最显著，分别高出对照52%和39.3%（图7A）。柠檬酸处理也显著提高苹果果实CAT和APX活性，两者均在贮藏第4天出现峰值，分别高于对照19.3%和22.2%（图7B、C）。

3 讨 论

本实验研究表明，不同质量分数柠檬酸均能抑制处理后损伤接种P. expansum苹果果实的病斑直径，其中以1%柠檬酸处理的抑制效果最佳。离体条件下柠檬酸对P. expansum的孢子萌发有明显抑制作用，其中1%柠檬酸抑制率最大。葛永红等[10]研究发现，离体条件下柠檬酸处理抑制了A. alternata菌丝生长，其中以2%柠檬酸效果最佳。并且，2%柠檬酸处理能够有效抑制处理后损伤接种A. alternata甜瓜果实的病斑直径。由此表明，柠檬酸处理的质量分数会对其控制腐烂的效果产生明显的影响，本实验所筛选1%柠檬酸处理对损伤接种病原物的抑制效果最佳，过高质量分数效果并不明显。在马铃薯上的研究[9]也发现，柠檬酸诱导产生的抗病性与其质量分数有关，高质量分数效果不明显且产生药害。采后苹果酸诱导苹果果实抗病性的研究[17]也发现高含量的苹果酸并不能降低果实采后青霉病。这可能是高含量的有机酸影响了果实的呼吸或其他代谢。说明只有一定含量的柠檬酸才能有效启动果实的防卫反应，更高含量并不能增加防卫反应的强度，并且柠檬酸的含量因果实和病原物的不同而存在明显的差异。

柠檬酸处理对苹果青霉病的抑制与其激活防御酶活性密切相关。据报道，多种防御酶在产品的抗病性反应中具有积极的作用[18]。1%柠檬酸处理后果实体内APX、POD和CAT活性显著升高。在果实体内POD参与木质素的合成，以及细胞壁的交联化反应，从而加固细胞壁抵抗病原物的侵染[19-20]。此外，POD也参与细胞内活性氧的清除，避免活性氧的过量积累[19]。厚皮甜瓜果实上的研究也发现，采后柠檬酸处理诱导了果实体内POD活性的升高，从而提高了果实的抗病性[10]。CAT专一地作用于H2O2，将H2O2分解为水和氧气，从而降低了H2O2的积累，减少对寄主的伤害[20]。APX能够经抗坏血酸-谷胱甘肽循环分解H2O2为水分子[15]。越来越多的研究证明，抗氧化酶的协同作用比单一酶在植物抗氧化过程中更具重要性[9]。由此表明，柠檬酸处理提高苹果果实的抗病性与体内抗氧化酶活性的提高密切有关。柠檬酸诱导果实抗病性的提高还与活化果实体内苯丙烷代谢关键酶活性提高和抗菌物质的积累有关[9-10]。

果实采收后依然是鲜活的个体，为维持其正常生理功能必然要消耗体内的一些营养物质，从而造成品质的下降，而品质劣变和果实衰老是限制果实贮藏的主要因素。这些品质成分包括水分、香气物质、果胶物质、糖、酸、抗坏血酸等[21]。本实验结果表明，苹果果实在贮藏期间硬度、可滴定酸质量分数下降，可溶性固形物质量分数和抗坏血酸含量先升高后下降，呼吸强度升高出现呼吸高峰后开始下降，质量损失率逐渐增加，说明果实逐渐进入衰老阶段，柠檬酸处理能够有效减缓果实硬度、抗坏血酸含量、可滴定酸和可溶性固形物质量分数的下降及质量损失率的升高，并且推迟了果实呼吸高峰的出现，从而延缓果实采后衰老速率，延长了其贮藏时间。曹建康等[7]在鸭梨果实上的研究发现，采后柠檬酸处理有效延缓了贮藏过程中果实硬度、可溶性固形物、可滴定酸和抗坏血酸含量的下降。因此，柠檬酸处理能明显保持果实品质和增加耐贮性。

4 结 论

离体条件下1%柠檬酸显著抑制了P. expansum的孢子萌发，显著降低了损伤接种苹果果实P. expansum病斑直径。柠檬酸处理显著提高果实POD、CAT和APX活性，同时还有效延缓了果实质量损失率的升高，抑制果实硬度、抗坏血酸含量、可滴定酸和可溶性固形物质量分数的下降，并且推迟了果实呼吸高峰的出现，从而延缓果实采后衰老速率，延长了其贮藏期。

[1] 邵兴锋, 屠康, 静玮, 等. 热处理对红富士苹果贮藏期间青霉病的抑制效果[J]. 园艺学报, 2007, 34(3): 743-746.

[2] SPADARO D, VOLA R, PIANO S, et al. Mechanism of action and efficacy of four isolates of the yeast Metschinikowia pulcherrima active against post-harvest pathogens on apples[J]. Postharvest Biology and Technology, 2002, 24(2): 123-134.

[3] CALVO J, CALVENTE V, de ORELLANO M E, et al. Biological control of postharvest spoilage caused by Penicillium expansum and Botrytis cinerea in apple by using the bacterium Rhonella aquatilis[J]. International Journal Food Microbiology, 2007, 113(3): 251-257.

[4] DROBY S, WISNIEWSKI M, MACARISIN D, et al. Twenty years of postharvest biocontrol research: Is it time for a new paradigm[J]. Postharvest Biology and Technology, 2009, 52(2): 137-145.

[5] 张兰, 郑永华, 苏新国, 等. 酸处理对蚕豆保鲜的效果[J]. 食品工业科技, 2003, 24(4): 76-77.

[6] 郑小林, 吴小业. 柠檬酸处理对采后芒果保鲜效果的影响[J]. 食品科学, 2010, 31(18): 381-384.

[7] 曹建康, 姜微波. 柠檬酸处理对鸭梨果实贮藏特性的影响[J]. 食品科技, 2005, 30(10): 84-87.

[8] ZHAO Z H, LIU M J, LIU P, et al. Effects of citric acid treatments on the postharvest fruit quality of Ziziphus jujuba Mill. ‘Linyilizao’[J]. Acta Horticulturae, 2009, 840: 513-516.

[9] 张庆春, 李永才, 毕阳, 等. 柠檬酸处理对马铃薯干腐病的抑制作用及防御酶活性的影响[J]. 甘肃农业大学学报, 2009, 44(3): 146-150.

[10] 葛永红, 王毅, 毕阳. 柠檬酸处理对厚皮甜瓜黑斑病的抑制及苯丙烷代谢的作用[J]. 食品工业科技, 2013, 34(19): 308-311.

[11] BI Yang, TIAN Shiping, ZHAO Jie, et al. Harpin induces local and systemic resistance against Trichothecium roseumin harvested hami melons[J]. Postharvest Biology and Technology, 2005, 38(2): 183-187.

[12] 韩雅珊. 食品化学实验指导[M]. 北京: 中国农业大学出版社, 1992: 66-72.

[13] 任亚琳, 毕阳, 葛永红, 等. BTH浸泡处理对厚皮甜瓜采后病害的控制及贮藏品质的影响[J]. 食品科学, 2013, 34(2): 267-272.

[14] 任邦来, 张燕. 水杨酸对番茄保鲜效果的影响[J]. 中国食物与营养, 2012, 18(7): 37-40.

[15] REN Yaling, WANG Yunfei, BI Yang, et al. Postharvest BTH treatment induced disease resistance and enhanced reactive oxygen species metabolism in muskmelon (Cucumis melo L.) fruit[J]. European Food Research and Technology, 2012, 234: 963-969.

[16] CAO Jiankang, JIANG Weibo. Induction of resistance in Yali pear (Pyrus bretschneideri Rehd.) fruit against postharvest diseases by acibenzolar-S-methyl sprays on trees during fruit growth[J]. Scientia Horticulturae, 2006, 110: 181-186.

[17] 伍利芬, 毕阳, 李红霞, 等. 苹果酸处理对苹果青霉病的控制和抗性的诱导[J]. 食品工业, 2012, 33(3): 42-44.

[18] SMITH C J. Accumulation of phytoalexins: defense mechanism and stimulus response[J]. Phytopathology, 1996, 132: 1-45.

[19] 葛永红, 毕阳, 李永才, 等. 苯并噻重氮(ASM)对果蔬采后抗病性的诱导及机理[J]. 中国农业科学, 2012, 45(16): 3357-3362.

[20] BRISSON L F, TENHAKEN R. Function of oxidative cross-linking of cell wall structural proteins in plant disease resistance[J]. Plant cell, 1994, 6: 1703-1712．

[21] 潘腾飞, 李永裕, 邱栋梁. 果实品质形成的分子机理研究进展[J]. 亚热带植物科学, 2006, 35(1): 81-84.

Effect of Postharvest Citric Acid Treatment on Controlling Blue Mould and Preserving the Quality of Apple Fruits during Storage

GE Yong-hong1, LI Can-ying1, ZHU Dan-shi1, LI Ying-qi2, LIU Jing2
(1. College of Chemistry, Chemical Engineering and Food Safety, Bohai University, Jinzhou 121013, China; 2. College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

Apple (cv. Qingguan) fruits which had been wounded and artificially inoculated with Penicillium expansum were subjected to dipping treatments with different concentrations of citric acid and subsequent storage at room temperature in order to investigate the inhibition of lesion development and the preservation of apple fruit by citric acid treatment. In vitro test indicated that citric acid inhibited spore germination of P. expansum, and 1% citric acid showed the highest inhibitory rate. In vivo test indicated that 1% citric acid was the optimal concentration for controlling blue mould of apple fruits. Postharvest citric acid treatment significantly increased the activities of peroxidase (POD), catalase (CAT) and ascorbate peroxidase (APX), delayed the increase in weight loss and the decreases in hardness and the contents of titratable acid, ascorbic acid and soluble solid, and postponed the respiration peak in apple fruits.

citric acid; apple fruit; quality; postharvest

TS255.3

A

1002-6630（2014）22-0255-05

10.7506/spkx1002-6630-201422050

2014-04-11

国家自然科学基金地区科学基金项目（31160405）；渤海大学博士启动基金项目（bsqd201405）；辽宁省食品安全重点实验室开放课题项目（LNSAKF2013021）

葛永红（1979—），男，副教授，博士，研究方向为果蔬贮藏与保鲜。E-mail：geyh1979@163.com