Bcl-2家族促凋亡蛋白Bim在骨改建中的作用及调节

宋祥晨(综述)，梁 敏(审校)

(中山大学光华口腔医学院附属口腔医院牙周病科 广东省口腔医学重点实验室，广州 510055)

人的一生中骨组织不断地进行着改建，骨改建是由骨吸收与骨形成精密控制的生理过程，其中破骨细胞、成骨细胞分别是骨吸收、骨形成的功能细胞[1]。细胞凋亡在胚胎肢体骨发育、骨改建中发挥重要作用，其中骨细胞即终末分化的成骨细胞凋亡增多被认为是骨改建活跃的标志；行使骨吸收功能后，破骨细胞迅速发生凋亡，骨吸收造成的骨陷窝由成骨细胞占据并形成新骨，随后部分成骨细胞被骨基质包埋转变为骨衬细胞，其余发生凋亡。由此可见，成骨细胞、破骨细胞凋亡对骨改建起着重要作用[2]。Bcl-2 interacting mediator of cell death(Bim)是Bcl-2家族促凋亡蛋白成员，介导内在凋亡通路的发生，并广泛参与健康细胞及肿瘤细胞凋亡[3-5]。该文就Bim在骨改建中的作用进行综述。

1 细胞凋亡

细胞凋亡是程序性细胞死亡，是受基因调控的细胞自灭过程，在维持机体正常发育，稳定内环境，清除肿瘤细胞、自身反应性淋巴细胞和微生物感染细胞中具有重要意义。细胞凋亡主要由死亡受体信号通路、线粒体信号通路介导[6]。线粒体信号通路又称内在通路，由Bcl-2家族成员介导[7]。根据结构与功能的差异，Bcl-2家族成员可分为三种亚型：①含有多个BH域的抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xL等；②含有多个BH域的促凋亡蛋白，包括Bak和Bax；③唯BH3域蛋白，包括Bim、Bid、Bad、BNIP3等[8]。唯BH3域蛋白在组织发育、维持内环境稳定及防治肿瘤中发挥作用。在外界刺激作用下，唯BH3域蛋白表达增高或活性增强后激活Bak/Bax。活化的Bak/Bax形成六聚体聚集在线粒体外膜形成孔道，导致细胞色素C的释放，与凋亡酶激活因子Apaf-1、ATP结合形成的多聚体募集并活化胱天蛋白酶(caspase)-9，最终激活下游执行者caspase-3、caspase-7，导致细胞凋亡[8-9]。

2 Bim的结构与生物学功能

2.1Bim的发现及结构 Bim是唯BH3域蛋白家族中的一员。O′Connor等[10]于1998年使用32P标签的Bcl-2蛋白是从T细胞淋巴瘤KO52DA20建立的λ噬菌体cDNA中筛选获得；同年Hsu等[11]，使用酵母二元杂交从卵巢cDNA中筛选出与髓细胞白血病基因1(Mcl-1)结合的Bcl-2-related ovarian death agonist(BOD)，证实是Bim的直系同源蛋白质。

由于mRNA选择性剪接的差异，Bim mRNA存在三种亚型：BimEL、BimL、BimS。O′Connor等[10]发现 3种翻译后产物BimEL、BimL、BimS均可通过BH3结构域与Bcl-2蛋白结合，其中BimS拮抗Bcl-2的抗凋亡作用最强。Adachi等[12]根据结构的差异，将后续发现的18种Bim亚型分为6组：BimEL、BimL、BimS、BimD、BimDd和BimEDd。其中小鼠BimEL含196个氨基酸，除含有BH3结构域外，还包含2个泛素化位点、3个核糖体蛋白S6激酶磷酸化位点、1个β-transducinrepeats-containingproteins(β-TrCP)结合模板、3个胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)磷酸化位点和1个c-Jun氨基端激酶磷酸化位点[13]。

2.2Bim的生物学功能 正常情况下，BimEL/L结合于微管动力蛋白轻链1/动力蛋白轻链亚基(LC8)，形成微管动力蛋白复合体。在凋亡信号刺激下，c-Jun氨基端激酶活化，并磷酸化Bim位于动力蛋白结合域的Ser56，致Bim与LC8同时从动力蛋白复合体上释放，并参与凋亡活动[14]。

Bim可通过直接结合和间接替代两种模式激活Bak/Bax。①直接结合模式：Bim直接与Bak/Bax结合致其发生构象改变而活化；②间接替代模式：Bim与所有Bcl-2抗凋亡蛋白家族成员均具较高的亲和力，故Bim可将Bak/Bax从Mcl-1/Bcl-xL中替代出来而活化[15]。除此之外，Weber等[16]发现BimS还可直接插入线粒体外膜，致细胞发生凋亡，而不依赖与Bcl-2/Mcl-1或Bak/Bax的结合。

2.3Bim在骨改建中的作用及调节机制 骨改建过程包括破骨细胞激活期、吸收期、逆转期、成骨细胞成骨期，由基础多细胞单位完成[17]。基础多细胞单位含有3种细胞成分：破骨细胞、成骨细胞、骨细胞。细胞凋亡影响成骨细胞与破骨细胞的数量及功能，从而调节骨代谢平衡，而Bim作为细胞凋亡的重要调节因子，在骨改建中发挥关键作用。

2.3.1Bim在破骨细胞中的作用及调节机制 骨改建往往由破骨细胞行使骨吸收开始，Bim在破骨细胞凋亡中的作用及调节研究较多。Akiyama等[18]发现，破骨细胞在营养因子(巨噬细胞集落刺激因子)缺乏时迅速凋亡并伴随Bim表达上调；而敲除bim基因的破骨细胞，体内外存活率均升高。Houde等[19]和Sugatani等[20]通过siRNA干扰破骨细胞bim基因表达后均发现破骨细胞凋亡减少及存活率增加。Bim在破骨细胞凋亡中的作用机制研究表明，巨噬细胞集落刺激因子、核因子κB受体活化因子配体缺乏时，转化生长因子β可上调Smad2及p38 Bim表达而诱导破骨细胞凋亡[19]。Matsumoto等[21]证实，含氮二磷酸利塞膦酸盐经内在凋亡通路上调Bim表达来诱导破骨细胞凋亡，而对敲除bim基因(bim-/-)小鼠及转染促分裂原活化的蛋白激酶激酶1的破骨细胞无凋亡作用。以上研究提示，Bim在破骨细胞凋亡中发挥重要作用。

Bim除在破骨细胞凋亡中发挥作用外，对破骨细胞骨吸收能力也有影响。Akiyama等[18]发现与野生型(bim+/+)相比，bim-/-的小鼠破骨细胞，其骨吸收能力降低，同时bim-/-小鼠可出现轻微的骨质硬化；而bim-/-的破骨细胞转染bimL后细胞存活率降低，同时伴有骨吸收能力恢复。Bcl-2家族抗凋亡成员Bcl-xL的相关研究[23]表明，过表达Bcl-xL/SV40 T抗原基因的小鼠破骨细胞，其宿主小鼠同样出现骨质硬化现象；Iwasawa等[24]进一步发现，Bcl-xL可通过降低细胞外基质的分泌而减弱破骨细胞的骨吸收能力，因此推测促凋亡蛋白Bim与Bcl-2家族抗凋亡蛋白之间的平衡对骨代谢至关重要。

大量研究发现，在肿瘤细胞、神经细胞、心肌细胞凋亡中Bim存在基因水平、蛋白合成水平及蛋白合成后水平等多层次调节，而Bim在破骨细胞凋亡中的调节主要是蛋白合成后水平的调节[4,25-29]。Akiyama等[18]、Wakeyama等[30]和Bradley等[31]相继证实破骨细胞凋亡中bim mRNA表达并未发生改变，但Akiyama等[18]发现Bim在破骨细胞中受c-Cbl介导的泛素化蛋白酶体降解调控。Bradley等[31]研究同样证实转录因子EGR-2可通过上调c-Cbl表达降解Bim。Purev等[32]进一步证实，敲除破骨细胞c-Cbl、Cbl-b基因可显著上调Bim表达并诱导破骨细胞凋亡，同时破坏细胞伪足小体及微管系统，推断Cbl家族可通过调节细胞支架影响Bim的泛素化降解。针对破骨细胞凋亡中Bim的调节机制，Sugatani等[20]、Wakeyama等[30]先后发现破骨细胞中存在mTOR-Bim、Caspase-Bim负反馈调控。Matsumoto等[21]对利塞膦酸盐骨保护机制的研究显示，破骨细胞敲除bim及转染促分裂原活化的蛋白激酶激酶1均可抑制利塞膦酸盐的破骨细胞凋亡诱导作用，但无法抑制利塞膦酸盐的骨保护作用，而只有转染蛋白激酶B(Akt)能够促进骨吸收；利塞膦酸盐在bim-/-小鼠中起着与野生型小鼠相同的骨保护作用：证实ERK/Bim通路调控小鼠破骨细胞凋亡，而Akt通路可能通过细胞骨架调控破骨细胞骨吸收。

2.3.2Bim在成骨细胞中的作用及调节机制 成骨细胞形成新骨是骨改建的完成阶段。成骨细胞凋亡在骨改建过程中同样发挥作用，而Bim是成骨细胞凋亡的重要调节因子[33]。Espina等[34]证实，生理状态下小鼠前成骨细胞系小鼠骨髓间质细胞中促凋亡蛋白Bim表达很低，高浓度肾上腺皮质激素作用24～48 h后Bim的表达增高，同时伴有大量细胞凋亡，且随着肾上腺皮质激素作用时间及浓度的增加，Bim的表达及细胞凋亡也随之上调；siRNA干扰bim表达可降低小鼠骨髓间质细胞凋亡比例。血清饥饿致成骨细胞凋亡机制的研究进一步证实Bim在介导成骨细胞凋亡过程中起关键作用[35]。Kawamura等[36]在血清饥饿诱导小鼠前成骨细胞MC3T3-E1凋亡中同样证实，Bim表达呈时间依赖性升高，而Bax、Bcl-2及Bcl-xL表达均未发生改变；siRNA干扰bim后活化的胱天蛋白酶3表达也随之降低。以上研究说明，Bim介导成骨细胞凋亡。

Bim在成骨细胞凋亡中存在多水平调节。Espina等[34]证实，血清饥饿从基因水平上调成骨细胞Bim mRNA表达。Kawamura等[36]进一步对Bim基因水平调节的研究表明，叉头样转录因子O3a结合bim启动子后可启动其转录，增强转录活性，而Akt1可通过磷酸化叉头样转录因子O3a、阻止其核转移而抑制bim转录活性及成骨细胞凋亡，另一方面敲除Akt1(Akt1-/-)的成骨细胞叉头样转录因子O3a磷酸化减弱、核转移降低、成骨细胞凋亡率下降。Purev等[32]同样发现ERK/蛋白激酶B抑制Bim mRNA及蛋白表达，推断ERK/蛋白激酶B通路下调Bim基因表达。Guo等[37]敲除成骨细胞miR-17～92a可促进地塞米松诱导的成骨细胞凋亡，而过表达miR-17～92a可加强雌激素对成骨细胞的抗凋亡作用，进一步研究发现miR-17～92a可与Bim 3′-非翻译区域结合而抑制Bim表达。Liang等[35]在成骨细胞凋亡中发现Bim受蛋白水平调节。蛋白合成后，蛋白酶体抑制剂MG132可显著上调成骨细胞Bim的表达，提示Bim受蛋白酶体的降解调控[35]。

3 小 结

骨改建包括骨形成与骨吸收，两者的平衡对骨稳态十分重要。目前的研究已证实，除在破骨细胞凋亡中发挥重要作用外，Bim对破骨细胞的骨吸收能力也有一定的影响，但具体机制尚不清楚。Bim在破骨细胞凋亡中存在c-Cbl介导的泛素化蛋白酶体降解调控，但基因水平及蛋白合成水平调控目前尚未证实。与破骨细胞相比，生理状态下成骨细胞中Bim的表达很低；而在肾上腺素、血清饥饿等刺激下，Bim表达上调并伴有细胞凋亡。Bim同样介导成骨细胞凋亡并存在多水平、多层次调节。

[1] 于世凤.骨吸收与骨形成[J].现代康复,2001,5(2):10-13.

[2] Stevens HY,Reeve J,Noble BS.Bcl-2,tissue transglutaminase and p53 protein expression in the apoptotic cascade in ribs of premature infants[J].J Anat,2000,196(Pt 2):181-191.

[4] Suzuki S,Yokoyama U,Abe T,etal.Differential roles of epac in regulating cell death in neuronal and myocardial cells[J].J Biol Chem,2010,285(31):24248-24259.

[5] Mao H,Gu H,Qu X,etal.Involvement of the mitochondrial pathway and Bim/Bcl-2 balance in dihydroartemisinin-induced apoptosis in human breast cancer in vitro[J].Int J Mol Med,2013,31(1):213-218.

[6] Duprez L,Wirawan E,Vanden Berghe T,etal.Major cell death pathways at a glance[J].Microbes Infect,2009,11(13):1050-1062.

[8] Lomonosova E,Chinnadurai G.BH3-only proteins in apoptosis and beyond:an overview[J].Oncogene,2008,27 Suppl 1:S2-S19.

[9] Letai A,Bassik MC,Walensky LD,etal.Distinct BH3 domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis,serving as prototype cancer therapeutics[J].Cancer Cell,2002,2(3):183-192.

[10] O′Connor L,Strasser A,O′Reilly LA,etal.Bim:a novel member of the Bcl-2 family that promotes apoptosis[J].EMBO J,1998,17(2):384-395.

[11] Hsu SY,Lin P,Hsueh AJ.BOD(Bcl-2-related ovarian death gene) is an ovarian BH3 domain-containing proapoptotic Bcl-2 protein capable of dimerization with diverse antiapoptotic Bcl-2 members[J].Mol Endocrinol,1998,12(9):1432-1440.

[12] Adachi M,Zhao X,Imai K.Nomenclature of dynein light chain-linked BH3-only protein Bim isoforms[J].Cell Death Differ,2005,12(2):192-193.

[13] Akiyama T,Tanaka S.Bim:guardian of tissue homeostasis and critical regulator of the immune system,tumorigenesis and bone biology[J].Arch Immunol Ther Exp(Warsz),2011,59(4):277-287.

[14] Puthalakath H,Huang DC,O′Reilly LA,etal.The proapoptotic activity of the Bcl-2 family member Bim is regulated by interaction with the dynein motor complex[J].Mol Cell,1993,3(3):287-296.

[15] Willis SN,Chen L,Dewson G,etal.Proapoptotic Bak is sequestered by Mcl-1 and Bcl-xl,but not Bcl-2,until displaced by BH3-only proteins[J].Genes Dev,2005,19(11):1294-1305.

[16] Weber A,Paschen SA,Heger K,etal.BimS-induced apoptosis requires mitochondrial localization but not interaction with anti-apoptotic Bcl-2 proteins[J].J Cell Biol,2007,177(4):625-636.

[17] Doll B,Aleef M,Hollinger JO.Overview of fracture repair[M]//Pietrzak WS.Musculoskeletal Tissue Regeneration:Humana Press,2008:39-61.

[18] Akiyama T,Bouillet P,Miyazaki T,etal.Regulation of osteoclast apoptosis by ubiquitylation of proapoptotic BH3-only Bcl-2 family member Bim[J].EMBO J,2003,22(24):6653-6664.

[19] Houde N,Chamoux E,Bisson M,etal.Transforming growth factor-beta1(TGF-beta1) induces human osteoclast apoptosis by up-regulating Bim[J].J Biol Chem,2009,284(35):23397-23404.

[20] Sugatani T,Hruska KA.Akt1/Akt2 and mammalian target of rapamycin/Bim play critical roles in osteoclast differentiation and survival,respectively,while Akt is dispensable for cell survival in isolated osteoclast precursors[J].J Biol Chem,2005,280(5):3583-3589.

[21] Matsumoto T,Nagase Y,Iwasawa M,etal.Distinguishing the proapoptotic and antiresorptive functions of risedronate in murine osteoclasts:role of the Akt pathway and the ERK/Bim axis[J].Arthritis Rheum,2011,63(12):3908-3917.

[22] Miyazaki T,Katagiri H,Kanegae Y,etal.Reciprocal role of ERK and NF-kappaB pathways in survival and activation of osteoclasts[J].J Cell Biol,2000,148(2):333-342.

[23] Hentunen TA,Reddy SV,Boyce BF,etal.Immortalization of osteoclast precursors by targeting Bcl-XL and Simian virus 40 large T antigen to the osteoclast lineage in transgenic mice[J].J Clin Invest,1998,102(1):88-97.

[24] Iwasawa M,Miyazaki T,Nagase Y,etal.The antiapoptotic protein Bcl-xL negatively regulates the bone-resorbing activity of osteoclasts in mice[J].J Clin Invest,2009,119(10):3149-3159.

[25] Ha Thi HT,Lim HS,Kim J,etal.Transcriptional and post-translational regulation of Bim is essential for TGF-β and TNF-α-induced apoptosis of gastric cancer cell[J].Biochim Biophys Acta,2013,1830(6):3584-3592.

[26] Xie B,Wang C,Zheng Z,etal.Egr-1 transactivates Bim gene expression to promote neuronal apoptosis[J].J Neurosci,2011,31(13):5032-5044.

[27] Yao M,Nguyen TV,Pike CJ.Estrogen regulates Bcl-w and Bim expression:role in protection against β-amyloid peptide-induced neuronal death[J].J Neurosci,2007,27(6):1422-1433.

[28] Lelièvre EC,Plestant C,Boscher C,etal.N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation[J].PLoS One,2012,7(3):e33206.

[29] Qian L,Van Laake LW,Huang Y,etal.miR-24 inhibits apoptosis and represses Bim in mouse cardiomyocytes[J].J Exp Med,2011,208(3):549-560.

[30] Wakeyama H,Akiyama T,Takahashi K,etal.Negative feedback loop in the Bim-caspase-3 axis regulating apoptosis and activity of osteoclasts[J].J Bone And Miner Res,2007,22(10):1631-1639.

[31] Bradley EW,Ruan MM,Oursler MJ.Novel pro-survival functions of the kruppel-like transcription factor Egr2 in promotion of macrophage colony-stimulating factor-mediated osteoclast survival downstream of the MEK/ERK pathway[J].J Biol Chem,2008,283(12):8055-8064.

[32] Purev E,Neff L,Horne WC,etal.c-Cbl and Cbl-b act redundantly to protect osteoclasts from apoptosis and to displace HDAC6 from beta-tubulin,stabilizing microtubules and podosomes[J].Mol Biol Cell,2009,20(18):4021-4030.

[33] Hock JM,Krishnan V,Onyia JE,etal.Osteoblast apoptosis and bone turnover[J].J Bone Miner Res,2001,16(6):975-984.

[34] Espina B,Liang M,Russell RG,etal.Regulation of bim in glucocorticoid-mediated osteoblast apoptosis[J].J Cell Physiol,2008,215(2):488-496.

[35] Liang M,Russell G,Hulley PA.Bim,Bak,and Bax regulate osteoblast survival[J].J Bone Miner Res,2008,23(5):610-620.

[36] Kawamura N,Kugimiya F,Oshima Y.Akt1 in osteoblasts and osteoclasts controls bone remodeling[J].PLoS ONE,2007,2(10):e1058.

[37] Guo L,Xu J,Qi J,etal.MicroRNA-17-92a upregulation by estrogen leads to Bim targeting and inhibition of osteoblasts apoptosis.[J].J Cell Sci,2013,126(Pt 4):978-988.