急性胰腺炎发病中腺泡细胞自噬与凋亡机制关系的研究进展

叶 浩综述，张树友审校

0 引 言

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一种具有较高发病率和病死率的临床常见急腹症，一般分为轻症AP(mild acute pancreatitis，MAP)和重症AP(severe acute pancreatitis，SAP)，约 20% ～30% 的患者可发展为SAP并导致多器官功能衰竭，总体病死率为5% ～10%［1］。AP目前无特殊药物及治疗方法。近年来随着医疗及护理水平的提高，该病病死率有所下降，介入治疗如内窥镜逆行胰胆管造影术(endoscopic retrograde cholangiopancreatography，ERCP)等手术治疗可降低SAP住院患者的病死率。人们对细胞凋亡及坏死在AP中的作用及其机制进行了比较深入的研究，认为凋亡在AP中作为一个保护机制，抑制凋亡则会使AP病情加重。自噬是继细胞凋亡和坏死之后AP腺泡细胞死亡方式的又一研究热点，但目前国内外对其在AP中的作用及其机制还处于起步阶段。

1 细胞主要死亡方式

胰腺腺泡细胞凋亡和坏死是我们较为熟知的2种死亡方式。近年来，自噬性细胞死亡和胀亡也开始被人们认识并逐渐引起重视［2］。胀亡常伴有浆膜渗透屏障衰竭，进而引起细胞内酶及其他内容物释放，在组织学上的变化就是发展为坏死，即“肿胀性坏死”。除此之外，人们又发现了坏死性凋亡模式，并认为也是一种受调节的细胞死亡方式。坏死是人们早期从病理形态学特点定义细胞的一种死亡方式，是一种在较强应激状态下细胞的一种被动死亡方式，常伴有组织的炎症反应。起初认为凋亡是一种受调节的caspase依赖的机制，而坏死是由无调节的过程所致，然而越来越多的研究表明坏死也可作为一种程序性细胞死亡方式，它可从受调节的非caspases依赖的细胞信号途径中发生，其形态学特征像坏死，称为坏死性凋亡［3-4］。Zhou 等［5］认为，MLKL、PGAM5、Drp1、DAI、RIP1 和 RIP3 在程序性坏死信号转导中起关键作用。

1.1 凋亡 凋亡又称Ⅰ型程序性细胞死亡，目前关于凋亡机制的研究已比较明确，发现了许多关键的细胞靶因子参与了其过程，这其中包括caspases。在凋亡的整个过程中，牵涉到很多相关基因的参与表达，凋亡的典型细胞形态学改变包括:细胞皱缩、核浓缩、染色质边集、DNA降解、膜起泡、核和细胞质断裂成凋亡小体，后被邻近的细胞(包括周边的巨噬细胞和中枢神经系统的小胶质细胞)吞噬和降解。在这个过程中，细胞膜结构保持完整，防止细胞外碎片堆积，因此不伴炎症反应。参与凋亡的基因很多，主要包括Bcl-2家族和caspase家族。Messner等［6］指出，在特定情况下凋亡过程也许未完成，而接着继发坏死。当细胞由凋亡向坏死转换后导致细胞内炎症因子释放，导致炎症发生。

1.2 自噬 自噬又名Ⅱ型程序性细胞死亡，是继细胞凋亡之后细胞死亡方式的又一研究热点，为真核细胞所特有。自噬是指自噬体与溶酶体结合，自噬体由细胞通过双层膜结构包裹待降解产物形成，与溶酶体结合后通过溶酶体酶的降解，为细胞代谢提供能量并完成细胞的更新。自噬的形成过程包括4个阶段:启动阶段、延长阶段、成熟阶段及自噬体的裂解。自噬过程的分子机制复杂，目前研究表明，在哺乳动物及酵母菌中存在有超过30多种与自噬形成的相关基因(autophagy-related gene，Atg)［7］。自噬的调节亦是一个复杂的过程，参与到自噬过程中的信号转导分子非常复杂，自噬调控的信号通路包括mTOR途径和不依赖mTOR途径。自噬在细胞中的作用相当于一把“双刃剑”，研究表明:基质细胞衍生因子-1β可通过诱导骨髓间充质干细胞自噬从而使细胞存活［8］。但在特定状态下，过度的自噬过程的发生可引起凋亡细胞的程序性死亡，也叫自噬性程序性细胞死亡［9］。

2 凋亡和自噬在AP中的作用

2.1 凋亡与AP 研究表明，胰腺腺泡细胞凋亡在AP中有重要意义，被认为是一种保护机制［10］。抑制凋亡使AP症状明显加重，诱导凋亡则可改善AP的严重程度。很多基因参与了AP细胞凋亡，包括Bcl-2家族和caspase家族。Bcl-2家族可分为凋亡抑制基因如Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、mcl-1 等和凋亡促进基因如Bax、Bel-x5、Bak、Bad 等;caspase家族包括为细胞凋亡的起始者(caspase-2，caspase-8，caspase-9 和caspase-10)与执行者(caspase-3，caspase-6和 caspase-7)，研究证明caspase-3是哺乳动物细胞凋亡的关键酶［11］。近年来，有人提出与凋亡相关的微小RNA(MicroRNA，miRNA)参与了AP的发病，在大鼠AP模型中检测出可能与凋亡相关的miRNA，其中上调表达miRNA 5条，下调miRNA 3条，这为鉴定AP凋亡相关性miRNA 建立了实验基础［12］。

2.2 自噬与AP 胰酶的激活和炎症反应被认为是AP发生发展的关键机制，AP早期腺泡细胞中便发现大量空泡，研究证明蛋白酶原激活发生在这些空泡结构中，这些空泡是双层膜的，且膜上有自噬标志物LC3-Ⅱ的存在，这些空泡结构后期被证明是自噬泡。Mareninova等［13］认为受损的自噬参与了大鼠AP胰腺腺泡空泡形成及胰蛋白酶的激活;他们的动物模型降解自噬的长寿蛋白下降，包含某些细胞器如线粒体、高尔基体、内质网及细胞质中的一些可溶性蛋白的大量自噬泡的存在，提示自噬异常，而溶酶体蛋白酶的减少使自噬溶酶体增加，而溶酶体蛋白酶缺陷和不平衡(Cathepsin B与Cathepsin L)从而造成自噬溶酶体的降解能力下降，使得大量的酶原堆积在自噬溶酶体内引起酶原激活和细胞损伤，因此过多的自噬是引起酶原激活的原因，受损的自噬参与了胰蛋白酶原的激活。Mizushima等［14］报道，禁食的GFP-LC3小鼠胰腺组织中诱导了大量的自噬，并伴随酶原颗粒的减少，但没有产生与AP相似的形态学变化，揭示了正常的自噬功能并不是AP的发病原因。Feng等［15］认为，白细胞介素-22能通过抑制自噬使大鼠AP病情好转。Kim等［16］指出热休克蛋白(HSP70)与自噬在AP中有相关性。

2.3 自噬与凋亡在AP中的相互关系 自噬和凋亡在AP中的关系复杂，目前国内外关于此方面的研究比较少见，但在肿瘤细胞的研究中有相关报道。在AP发病中，自噬、凋亡往往共同参与调控腺泡细胞的命运。自噬参与了酶原的激活，而腺泡细胞凋亡被认为是一种保护机制，两者共同存在于AP中，关系相当复杂，对立统一存在于AP发病过程。

2.3.1 自噬对凋亡的影响 有人认为自噬可调控凋亡，自噬可抑制细胞凋亡从而使细胞存活，但也有人认为自噬和凋亡相互促进。研究表明:抑制AP胰腺腺泡细胞的自噬可促进细胞的凋亡［17］，因此抑制腺泡细胞的自噬可改善病情。在国内，有人以AP大鼠为对象，用自噬抑制剂3-MA抑制自噬后，发现凋亡现象增强［18］。在人乳腺癌细胞 MCF-7中，细胞自噬早于凋亡的发生，而凋亡能被自噬抑制剂如3-MA所抑制。在凋亡受损时，自噬也可作为备用方式造成细胞死亡，自噬自身亦可引起细胞死亡。Zhang等［19］认为自噬相关蛋白p62/SQSTM1可诱导凋亡的发生。

2.3.2 凋亡对自噬的影响 自噬和凋亡的关系本来就是一个争议很大的话题。Chvanov等［17］认为自噬与凋亡在AP发病中相互拮抗，抑制凋亡也会诱导胰腺腺泡细胞自噬性死亡。有人以内皮细胞为研究对象，认为凋亡对细胞自噬无明显影响，但在Hela细胞中，抑制凋亡，可使细胞自噬增强［20］。

总之，自噬与凋亡存在重要联系，在不同疾病、同一疾病不同发展阶段、不同组织中其相互作用机制不同。凋亡的调控机制很多，其中线粒体途径、死亡受体途径和内质网压力途径与自噬也存在联系。Djavaheri等［21］以实验证实在线粒体和死亡受体介导的细胞凋亡中，自噬相关蛋白Beclin 1是caspase 3、caspase 7、caspase 8的剪切对象，剪切后的 Beclin 1将失去自噬诱导活性，而具有促进细胞凋亡的作用。当细胞发生凋亡时，Atg5同样可被caspase剪切，与线粒体上的 Bcl-2相互作用失去自噬诱导活性，加速细胞凋亡性死亡［22］。自噬和凋亡信号通路分子调节机制相互交错，当细胞处于应激状态下，某一刺激信号可能激活其中一条信号通路，而与其相关联的分子信号往往又激活另一条信号通路并调整一些非常关键的基因。目前关于自噬与凋亡在AP中的关系，尚未见相关报道。有研究发现某些分子信号和信号通路相关蛋白在AP中表达异常，这些分子和通路同时与凋亡和自噬相关。

3 AP发病过程中与自噬和凋亡相关的共同分子机制

3.1 磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)/Akt PI3K包括多种亚单位和亚型，主要分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，PI3K/Akt/mTOR信号通路的构成包括 RTK→PI3K→PKB/Akt→TSC2/TSCl→Rheb→mTOR1/mToR2→S6Ks/4E-BPl。Akt又叫蛋白激酶B，是PI3K下游重要的分子，主要分为Akt1、Akt2和Akt3。近年研究表明 PI3K/Akt信号通路能经多种途径调节细胞凋亡，使细胞存活，其主要的机制包括:①BAD属于Bcl-2家族，BAD与Bcl-2或Bcl-xl形成复合体促进凋亡，BAD如被磷酸化，就能与伴侣蛋白(Chaperone)14-3-3结合，从而阻断BAD与Bcl-2/或Bcl-xl结合，抑制凋亡，而Akt是很强的BAD激酶。研究证明LY294002能阻止Akt引起的BAD磷酸化［23］。②直接或间接调控转录因子家族如 Forkhead、核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、p53 等，进一步调控细胞存活，NF-κB 活化后，促进细胞Bcl-xl表达。PI3K/Akt是调控细胞自噬的一条重要的信号通路，通过mTOR机制调节自噬。自噬体形成与AP时胰蛋白酶原的激活相关。研究表明:采用PI3K基因敲除建立的AP小鼠模型，发现胰腺炎炎症程度减轻，凋亡现象较前明显，但无明显自噬变化，提示PI3K可调控胰腺腺泡细胞凋亡［24］。对采用PI3Kγ基因敲除的AP小鼠模型，发现胰腺腺泡细胞自噬明显减轻，说明PI3K可增强自噬而促进酶原激活［25］。国内有学者认为:化疗药物可通过PI3K-Akt-mTOR信号通路诱导自噬从而降低肿瘤化疗敏感性［26］。

3.2 NF-κB 和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) 在AP中往往伴有转录因子NF-κB的激活，进而使多种促炎基因的转录。NF-κB被认为是AP炎症反应的一个关键因素。研究表明:硫化氢合成的相关酶胱硫醚7一裂解酶抑制剂(DL-propargylglycine，PAG)可诱导AP胰腺腺泡细胞凋亡从而对模型大鼠起保护作用，同时伴有NF-κB表达减弱，并认为这种由PAG诱导的凋亡可能与其抑制NF-κB活性相关联［27］。NF-κB调控的凋亡相关靶基因包括BCL-X，cIAPs等。在 AP发病过程中，NF-κB信号通路也参与了其他重要器官的损伤，其机制主要是促进细胞凋亡，如在AP肝损伤时，NF-κB增强肝枯否细胞凋亡从而加重AP肝损伤［28］。在AP肺损伤中也有相关报道。Yang等［29］认为:NF-κB可诱导 AP胰腺腺泡细胞自噬，NF-κB抑制剂PDTC(吡咯烷二硫代氨基甲酸盐)可抑制NF-κB活性减轻自噬从而抑制胰蛋白酶原的活化，因此抑制NF-κB活性可能对AP治疗有意义。TNF-α在AP发生时表达增高，有研究表明:TNF-α可调控AP时caspase-3的表达，抑制TNF-α、caspase-3阳性率，胰腺细胞的凋亡指数显著升高［30］。在AP发病中:TNF-α、白细胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)与肺损伤中 PMNs的凋亡延迟相关［31］。有学者指出:TNF-α诱导蛋白3相互作用蛋白1是重要的NF-κB调控蛋白，可调控NF-κB的表达及细胞凋亡［32］。另有研究提出，TNF-α亦参与了自噬的调节，Ye等［33］发现，TNF-α 可诱导细胞自噬的发生。

3.3 Bcl-2与Beclin Bcl-2是参与调控凋亡的关键因素，抗凋亡和促凋亡相互作用，共同调控线粒体结构及功能的稳定性。Bcl-2能通过BH3结构域与同族促凋亡蛋白结合而形成异原二聚体从而维持促凋亡蛋白在细胞内稳定分布。在AP中Bcl-2在防治腺泡细胞和导管上皮细胞过度凋亡中起作用。在AP中常伴有胰腺腺泡细胞凋亡，凋亡在AP中被认为是一种保护机制。Bcl-2常被用作为凋亡的检测指标。但近年来又有研究表明:Bcl-2可与自噬相关基因Beclin-1结合从而阻止其介导的细胞自噬［34］。研究表明:抗凋亡蛋白Bcl-2具有能够容纳BH3结构域的疏水凹槽且其能与Beclin1结合，结合后形成Bcl-2-Beclin1-Vps34复合物，使脂质激酶Vps34活性明显下降，可抑制Beclin1介导的自噬［35］。

3.4 Atg5 自噬过程包括很多Atg的参与，各种Atg在自噬发生发展过程中的不同阶段发挥不同作用，其中部分参与隔离膜的形成，部分参与自噬体的形成，部分参与自噬体与溶酶体的结合形成自噬溶酶体。各种自噬基因相互配合共同完成自噬过程。Atg5在自噬过程中是很重要的角色，在自噬体形成前期，Atg5和Atg12结合形成自噬共轭连接体Atg5-Atg12，为自噬形成所必须。对Atg5基因敲除小鼠腹腔注射雨蛙肽诱导AP模型，发现自噬现象明显减弱。但近年来研究表明，Atg5参与了凋亡信号的调控［36］。

3.5 caspase caspase是调控真核细胞凋亡的一类重要的细胞因子，但近年来有文献报道caspase亦参与了自噬的调控。有人提出，抑制caspase-8的表达，可诱导急性粒单细胞白血病u937细胞自噬，这种自噬可随着Beclin1和Atg7基因的沉默而被抑制，说明caspase-8调控自噬可能与Beclin1和Atg7有关［37］。随着AP病情的发展，凋亡逐渐减弱而自噬呈增强趋势，抑制Caspase活性使AP凋亡下调，病情加重。

4 结 语

AP腺泡细胞各种死亡方式相互关联，共同调控细胞命运，某种情况下相互转化。上述各种相关因子在AP中异常表达，可能直接或间接参与了自噬和凋亡的调控。P53、DRAM、DAPK等基因也可能成为自噬和凋亡的交叉点，主要表现于肿瘤细胞中。此外，ROS、HIF-α及钙超载等因素也被认为与自噬和凋亡有关。在AP中，细胞以何种方式死亡对病情的轻重程度影响较大，目前对凋亡在AP中的作用及其机制已比较深入，认为自噬参与了AP胰蛋白酶原的激活从而加重病情，但对其机制的研究尚处于起步阶段。自噬和凋亡在AP中的作用相当复杂，对其机制的阐明可指导我们采取正确的措施使腺泡细胞趋向于有益于病情发展的死亡方式，对AP的治疗有很大意义。

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