调控炎性细胞因子对骨修复的影响

郝健明(综述)，练克俭(审校)

(中国人民解放军第一七五医院骨科医院，福建漳州363000)

骨折愈合可以分为血肿炎症机化期、骨痂形成期和骨板塑形期。炎症是在骨折或骨损伤中发挥关键作用的生物反应。越来越多的研究表明，免疫系统可调控炎性反应，且可消灭炎症对骨破坏的影响[1-3]。炎症可分为细菌性和无菌性。细胞碎片和外来物均可刺激细胞产生很多细胞因子，从而发生一系列炎性反应。而细胞因子种类繁多，根据其对炎性反应的不同调控，可分为促炎因子和抗炎因子两大类。现就这两类因子对骨折愈合影响的国内外研究进展进行阐述。

1 促炎因子与骨修复

在临床环境中促炎因子因对骨的破坏性影响而出名。在骨组织工程战略中骨再生可能性也没有被广泛探讨。在生物材料研究中，肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)和其他炎性细胞因子是最有名的异物反应介质，炎性反应不仅会导致严重的组织损伤也会使植入材料过早失效[4]。促炎症分子也常会在风湿性疾病患者中影响骨代谢，关节炎患者中高水平的TNF-α和IL-1可直接导致关节和骨的破坏[5]。

1.1 TNF-α 慢性炎性刺激细胞产生活素类产物，导致内源性TNF-α大量聚集，刺激骨的再吸收和抑制骨生成。TNF-α是与骨吸收有关的一个细胞因子，破骨细胞被激活使骨吸收加速从而破坏骨组织。体外实验显示，TNF-α可抑制成骨细胞分化[6]。

TNF-α和相关分子是引发细胞死亡还是促进细胞存活取决于他们所结合的特定的细胞表面受体、细胞类型以及随后激活的胞内级联信号[7]。TNF-α 调节成骨细胞和破骨细胞的分化功能是通过TNF-α的两个细胞表面受体肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1)和TNFR2实现的。TNFR1始终存在于骨组织中，相比之下，TNFR2只在骨损伤后才会表达[8]。在体外培养系统中，TNF-α的信号会促进来自正常和TNFR1缺失小鼠细胞的骨形成。然而，在TNFR2缺失的细胞中，TNF-α的信号会刺激破骨细胞分化和骨吸收，结果是相反的[9]。TNFR2激活而产生的级联信号可能会调节TNF-α在骨折愈合中的再生效应[6，9]。

在骨折愈合过程中，TNF-α及其受体TNFR1和TNFR2表达遵循双相模式。小鼠骨损伤模型中24 h时TNF-α水平达峰值，72 h内恢复到基线水平。TNF-α在此期间主要是由巨噬细胞和其他炎性细胞的表达[8，10]。TNF-α可以诱导级联信号分子释放发挥趋化作用并招募骨再生所需的细胞。TNF-α的水平在软骨内骨形成约2周后再次上升。在此期间，TNF-α由成骨细胞和骨髓间充质源细胞表达，包括肥大软骨细胞进行软骨内成骨[8，11]。

TNF-α缺陷的小鼠骨折愈合明显受损，骨形成会延迟几周。在损伤后前2天每日局部注射TNF-α后导致4周后骨折愈伤组织矿化明显增加。然而，TNF-α缺陷的小鼠有正常的骨骼[12]。

TNF-α是重要的破骨细胞调控因子之一。体外研究表明，TNF-α刺激破骨细胞形成和骨吸收，增加骨髓培养时破骨细胞样细胞的形成[13]。TNF-α增加巨噬细胞的吞噬功能，对许多免疫细胞有趋化和黏附作用，使之定位在结核感染部位，对防止感染扩散起着很重要的作用[14]。TNF-α在骨髓基质细胞和破骨细胞前体细胞共培养中刺激破骨细胞形成的能力依赖于IL-1，但 TNF-α诱导骨溶解依赖于巨噬细胞刺激因子[15]。

尽管TNF-α对骨的影响已被研究了几十年，但也是在最近才确认，这种分子也可以发挥相反的作用，这取决于它被释放的环境。分子信号通路的刺激是TNF-α产生的间充质干细胞在体外诱导成骨细胞分化的原因，而抑制TNF-α的释放会减少成骨细胞分化的信号[7]。有研究认为，TNF-α也参与免疫病理，造成组织坏死。因此，TNF-α可依据具体的病理生理状态不同而发挥促炎症和抗炎症作用[16]。

1.2 IL-1 IL-1主要是由免疫活性细胞所分泌的具有广泛生物活性的多肽。与TNF-α不同，IL-1不影响骨骼发育，IL-1的缺乏不会影响体内骨折愈合[17]。然而，缺乏IL-1α和(或)IL-1β(IL-1的两种形式)的小鼠，相比正常小鼠具有较高的骨密度和股骨骨量，这已被归因于破骨细胞发育受损[18]。预培养的间充质干细胞诱导成骨细胞分化，暴露于IL-1β(无地塞米松)的培养液中，显示早期和晚期成骨细胞分化标志物有显著的剂量依赖性增加，而同时暴露于IL-1β和地塞米松却有相反的效果。最近的一项研究报道指出，每日局部IL-1β注射可在骨折后第3天导致体内骨再生轻微加速[17]。

IL-1虽然是一个独特的因子，但其对骨的效果在很大程度上与TNF-α重叠。与TNF-α相同，IL-1的表达也是双相模式。在骨折愈合的小鼠模型中，骨折后其水平立即上升，24 h后达到高峰，72 h则检测不到，IL-1在这样的炎性反应中主要体现在巨噬细胞的变化[8，19]。IL-1会触发 IL-6、前列腺素和其他促炎因子级联信号的释放，这也刺激血管生成和促进，稳定骨折部位的软骨痂形成。IL-1表达的第二个高峰期发生在损伤后大约3周，在此期间，IL-1主要是由成骨细胞表达并通过刺激蛋白酶降解愈伤组织来促进骨重构。

骨折愈合过程中IL-1的不同功能可以归结为IL-1两个受体(IL-1RⅠ和IL-1RⅡ)表达的差异。在骨折愈合的小鼠模型中，IL-1RⅡ的表达也遵循相同的双相模式。与此相反，IL-1RⅠ是在炎症阶段唯一可检测到的指标[8]。IL-1RⅠ缺陷小鼠骨量减少，且破骨细胞会增加到基础水平的2倍，在骨骼平衡中这种分子信号的重要性得以体现[20]。在关节炎的小鼠模型中，由于基因突变导致IL-1缺陷可以防止骨关节病。

1.3 IL-6 IL-6在正常骨骼发育和骨再生中是必需的。缺乏IL-6的小鼠骨密度降低，骨折愈合会受损[21]。在体外的成骨细胞分化研究中表明，暴露IL-63～6 d的成骨标志物Runx2和骨钙素基因的表达增加[22]。在体内骨折愈合模型中反复局部注射甲状旁腺激素片段和IL-6，在损伤后前2周会显著增加骨痂的机械强度并加速骨愈合。然而，此处理后会降低未受损伤的骨骼的机械强度[23]，这是因为全身性注射的效果，这也强调了需要一个控释系统，以提供有针对性的细胞因子传递到骨损伤的部位。

在骨再生的小鼠模型中，伤后IL-6立即上升并且在第1周结束时恢复到基线水平[10]。IL-6调控成骨细胞和破骨细胞的分化，并且还通过刺激血管内皮细胞生长因子的释放促进血管生成[21]。与TNF-α和 IL-1不同，IL-6的表达被限制在炎症期。在骨折愈合的重塑阶段IL-6保持在基线水平[10]。IL-6缺乏可显著延迟骨折愈合的早期阶段，包括骨折骨痂的矿化和重构。骨折2周后，IL-6缺陷的小鼠骨折部位矿化减少，软骨含量增加;伤后4周，骨折愈合与IL-6充满小鼠[21]。在人类患者中，IL-6骨折后几个月持续上升，较高的水平会致损伤部位的承重能力下降[24]。

1.4 IL-8 IL-8是由诸多细胞(如单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等)产生的具有趋化作用的早期炎性细胞因子。IL-8对中性粒细胞具有趋化作用，引导中性粒细胞变性及颗粒的释放，是中性粒细胞激活和迁移的重要调控因子和进入受伤组织的重要介质，是对损伤病理过程非常重要的细胞因子。TNF-α、IL-1β、内毒素和病毒等可诱导这些细胞产生IL-8。研究证明，在感染、创伤患者的血清及局部均可检测到高水平的IL-8，且IL-8的升高与疾病的进展、转归有关[25-26]。

2 抗炎因子与骨修复

2.1 IL-10 IL-10具有很强的抗炎及免疫抑制活性。它能抑制IL-2、干扰素γ及促炎因子的产生和释放，能抑制人的Th2导致细胞增生和细胞因子产生的减少。在体内，IL-10合成晚于促炎细胞因子。有研究显示，在脂多糖攻击约30 min后即可见促炎细胞因子的大量释放，而IL-10则在脂多糖攻击后6～8 h达到高峰，较促炎细胞因子反应延迟[27]。这一现象支持IL-10在体内发挥促炎反应负调控剂的角色。IL-10已在人类和动物模型炎性疾病证明能成功地减少炎症和改善功能。

Mohamed等[28]利用小鼠 RAW264.7巨噬细胞系和小鼠骨髓细胞研究得出，IL-10抑制小鼠和大鼠的破骨细胞形成和骨吸收功能，IL-10可通过抑制活化T细胞核因子c1的表达和核转位间接上调骨保护素的表达，下调成骨细胞的核因子κB受体活化剂配体和巨噬细胞刺激因子的表达，从而抑制破骨细胞形成。IL-10缺失小鼠骨质疏松，牙周泡状骨丢失显著增加[29]。

调节性T细胞可产生免疫调节分子，如IL-10和转化生长因子β，直接影响细胞毒性T细胞和抗原呈递细胞的功能;下调促炎细胞因子干扰素γ和TNF-α的产生及直接抑制IL-2 mRNA的转录，进而发挥免疫调节作用[30]。

2.2 IL-4 IL-4是由活化的T细胞产生的细胞因子，在体内、体外均证实IL-4可以抑制IL-1、IL-6和TNF分泌，并促进IL-1Ra产生，发挥抗炎作用。

IL-4是一个所谓的“抑制性细胞因子”，这是免疫学中的术语，倾向于抵消TNF-α和IL-1的促炎效应的分子[31]。IL-4的目标是抑制破骨细胞和成骨细胞在体内的骨重构。重组IL-4和IL-13的局部调节对治疗或预防骨质溶解可能更可行有效[32]。在一项研究中，植入异种脱钙骨基质刺激体内异位成骨，缺乏IL-4和IL-13减少新生血管形成，这一发现可能影响骨组织工程的发展策略[33]。

3 结语

正常且适度的炎性反应是机体的一种防御反应，可以促进骨折愈合;但是感染、类风湿性关节炎或其他原因引起的长期慢性炎性反应，则对骨折愈合不利。细胞因子在炎性反应应答调节机制中至关重要，是细胞与细胞间相互沟通的信号之一，细胞因子间相互协同或拮抗作用介导并维持细胞间的协调。细胞因子的变化可早期、准确地反映炎症状况。炎性细胞因子对骨的影响取决于其表达的时间和环境。一个单一的细胞因子可以促进骨修复和溶解。这些分子机制将会被进一步研究以便合理控制炎症和诱导骨再生。

[1]Mountziaris PM，Mikos AG.Modulation of the inflammatory response for enhanced bone tissue regeneration[J].Tissue Eng Part B Rev，2008，14(2):179-186.

[2]Takayanagi H.Osteoimmunology and the effects of the immune system on bone[J].Nat Rev Rheumatol，2009，5(12):667-676.

[3]Pape HC，Marcucio R，Humphrey C，et al.Trauma-induced inflammation and fracture healing[J].J Orthop Trauma，2010，24(9):522-525.

[4]Luttikhuizen DT，Harmsen MC，Van Luyn MJ.Cellular and molecular dynamics in the foreign body reaction[J].Tissue Eng，2006，12(7):1955-1970.

[5]Mabilleau G，Pascaretti-Grizon F，Basle MF，et al.Depth and volume of resorption induced by osteoclasts generated in the presence of RANKL，TNF-alpha/IL-1 or LIGHT[J].Cytokine，2012，57(2):294-299.

[6]Kim S，Koga T，Isobe M，et al.Stat1 functions as a cytoplasmic attenuator of Runx2 in the ranscriptional program of osteoblast differentiation[J].Genes Dev，2003，17(16):1979-1991.

[7]Locksley RM，Killeen N，Lenardo MJ.The TNF and TNF receptor superfamilies:integrating mammalian biology[J].Cell，2001，104(4):487-501.

[8]Kon T，Cho TJ，Aizawa T，et al.Expression of osteoprotegerin，receptor activator of NF-kappaB ligand(osteoprotegerin ligand)and related proinflammatory cytokines during fracture healing[J].J Bone Miner Res，2001，16(6):1004-1014.

[9]Balga R，Wetterwald A，Portenier J，et al.Tumor necrosis factoralpha:alternative role as an inhibitor of osteoclast formation in vitro[J].Bone，2006，39(2):325-335.

[10]Gerstenfeld LC，Cullinane DM，Barnes GL，et al.Fracture healing as a post-natal developmental process:molecular，spatial，and temporal aspects of its regulation[J].J Cell Biochem，2003，88(5):873-884.

[11]Rundle CH，Wang H，Yu H，et al.Microarray analysis of gene expression during the inflammation and endochondral bone formation stages of rat femur fracture repair[J].Bone，2006，38(4):521-529.

[12]Gerstenfeld LC，Cho TJ，Kon T，et al.Impaired fracture healing in the absence of TNF-alpha signaling:the role of TNF-alpha in endochondral cartilage resorption[J].J Bone Miner Res，2003，18(9):1584-1592.

[13]Yamashita T，Yao Z，Li F，et al.NF-kappaB p50 and p52 regulate receptor activator of NF-kappaB ligand(RANKL)and tumor necrosis factor-induced osteoclast precursor differentiation by activating c-Fos and NFATc1[J].J Biol Chem，2007，282(25):18245-18253.

[14]Mootoo A，Stylianou E，Arias MA，et al.TNF-alpha in tuberculosis:a cytokine with a split personality[J].Inflamm Allergy Drug Targets，2009，8(1):53-62.

[15]Wei S，Kitaura H，Zhou P，et al.IL-1 mediates TNF-induced osteoclastogenesis[J].J Clin Invest，2005，115(2):282-290.

[16]Ray JC，Flynn JL，Kirschner DE.Synergy between individual TNF-dependent functions determines granuloma performance for controlling Mycobacterium tuberculosisinfection[J].J Immunol，2009，182(6):3706-3717.

[17]Lange J，Sapozhnikova A，Lu C，et al.Action of IL-1beta during fracture healing[J].J Orthop Res，2010，28(6):778-784.

[18]Lee YM，Fujikado N，Manaka H，et al.IL-1 plays an important role in the bone metabolism under physiological conditions[J].Int Immunol，2010，22(10):805-816.

[19]Cho TJ，Gerstenfeld LC，Einhorn TA.Differential temporal expression of members of the transforming growth factor beta superfamily during murine fracture healing[J].J Bone Miner Res，2002，17(3):513-520.

[20]Bajayo A，Goshen I，Feldman S，et al.Central IL-1 receptor signaling regulates bone growth and mass[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102(36):12956-12961.

[21]Yang X，Ricciardi BF，Hernandez-Soria，A，et al.Callus mineralization and maturation are delayed during fracture healing in interleukin-6 knockout mice[J].Bone，2007，41(6):928-936.

[22]Li Y，Backesjo CM，Haldosen LA，et al.IL-6 receptor expression and IL-6 effects change during osteoblast differentiation[J].Cytokine，2008，43(2):165-173.

[23]Rozen N，Lewinson D，Bick T，et al.Fracture repair:modulation of fracture-callus and mechanical properties by sequential application of IL-6 following PTH 1-34 or PTH 28-48[J].Bone，2007，41(3):437-445.

[24]Miller RR，Cappola AR，Shardell MD，et al.Persistent changes in interleukin-6 and lower extremity function following hip fracture[J].J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2006，61(10):1053-1058.

[25]Mace JE，Park MS，Mora AG，et al.Differential expression of the immunoinflammatory response in trauma patients:burn vs.nonburn[J].Burns，2012，38(4):599-606.

[26]Kyriakidis I，Papa A.Serum TNF-alpha，sTNFR1，IL-6，IL-8 and IL-10 levels in hemorrhagic fever with renal syndrome[J].Virus Res，2013，175(1):91-94.

[27]Lauw FN，Pajkrt D，Hack CE，et al.Proinflammatory effects of IL-10during human endotoxemia[J].J Immunol，2000，165(5):2783-2789.

[28]Mohamed SG，Sugiyama E，Shinoda K，et al.Interleukin-10 inhibits RANKL-mediated expression of NFATc1 in part via suppression of c-Fos and c-Jun in RAW264.7 cells and mouse bone marrow cells[J].Bone，2007，41(4):592-602.

[29]Liu D，Yao S，Wise GE.Effect of interleukin-10 on gene expression of osteoclastogenic regulatory molecules in the rat dental follicle[J].Eur J Oral Sci，2006，114(1):42-49.

[30]Askenasy N，Kaminitz A，Yarkoni S.Mechanisms of Tregulatory cell function[J].Autoimmun Rev，2008，7(5):370-375.

[31]Lee SK，Lorenzo J.Cytokines regulating osteoclast formation and function[J].Curr Opin Rheumatol，2006，18(4):411-418.

[32]Wang Y，Wu NN，Mou YQ，et al.Inhibitory effects of recombinant IL-4 and recombinant IL-13 on UHMWPE-induced bone destruction in the murine air pouch model[J].J Surg Res，2013，180(2):e73-e81.

[33]Silfversward CJ，Sisask G，Larsson S，et al.Bone formation in interleukin-4 and interleukin-13 depleted mice[J].Acta Orthop，2008，79(3):410-420.