神经干细胞向神经元定向诱导分化方法的研究进展

杨晓青，刘英富，徐云强(综述)，陈旭义，李建国※(审校)

(1.天津中医药大学，天津300193;2.武警后勤学院附属医院脑系科，天津300162;3.武警后勤学院细胞生物学与医学遗传学教研室，天津300162;4.天津医科大学总医院骨科，天津300193)

神经干细胞(neural stem cell，NSCs)是一类具有自我更新能力和多种分化潜能的细胞，不仅存在于哺乳动物胚胎脑组织，而且在已发育成熟的中枢神经系统内也存在NSCs，其特点为:具有自我更新能力;具有未分化的原始神经细胞的表面标志物;通过不对称分裂产生除自身以外的其他神经细胞;具有迁移能力，能到达损伤或疾病的部位并产生新的神经细胞。NSCs具有分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力，而分化为的神经元在神经发育和修复受损神经组织中发挥重要作用。因此，寻求一种可以使NSCs定向分化为神经元的方法是国内外学者的研究热点。

1 生物学方法

1.1 胶质源性神经营养分子 胶质源性神经营养分子(glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF)属于转化生长因子β超家族成员之一，对大鼠中脑多巴胺能神经元(dopaminergicneurons，DN)有特异性营养作用;可挽救损伤后的DN，促进恢复及存活，并提高对多巴胺高亲和力摄取等作用，有效保护中脑的多巴胺循环，预防体内 DN的退行性病变[1]。陈梅玲等[2]研究也发现，GDNF可诱导 NSCs向 DN分化，并且细胞形态更成熟，而0.01 ng/L GDNF具有最佳的诱导效率。其机制可能是通过磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸蛋白激酶通道介导对DN存活和分化起作用[3]。

1.2 血管紧张素Ⅱ 血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是肾素-血管紧张素-醛固酮系统中主要的活性肽物质，主要由血管紧张素原、血管紧张素在水解酶作用下水解产生，具有影响细胞的增殖、生长、凋亡和调节炎症等作用[4]。研究发现，AngⅡ能通过其受体介导定向诱导NSCs向DN分化[5]，由于AngⅡ的作用，使沉默甲基磺酸敏感蛋白2基因得到表达，从而诱导 NSCs定向分化为DN。并且外源性AngⅡ促进NSCs向DA能神经元分化，在400～600 nmol/L水平范围内AngⅡ的诱导效能更显著;其机制可能与同时促进星型胶质细胞分化有关[6]。

1.3 促红细胞生成素 促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种含唾液酸的酸性热稳定(80℃)糖蛋白，近年来研究发现，EPO对中枢神经系统起到保护作用，主要是调节NSCs的生长、发育，抗神经细胞凋亡等[7-9]。研究表明，EPO可促进体外培养的鼠胚脑皮质NSCs增殖，且最佳浓度为0.005 U/L[10]。并且对体外培养鼠胚脑皮质NSCs凋亡及分化也有影响，EPO抑制NSCs凋亡促进其向神经元分化，通过EPO和EPO受体结合后，激活蛋白酪氨酸激酶，迅速诱导细胞内多种蛋白质酪氨酸磷酸化，启动信号转导通路，控制NSCs的增殖和分化[11]。也有研究发现，是通过Wnt/β联蛋白信号通路促进其向神经元方向分化的，所以其机制仍需进一步探讨[12-13]。

1.4 脑源性神经营养因子 脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factor，BDNF)广泛分布于中枢神经系统内。在中枢神经系统发育过程中，BDNF对神经元的存活、分化、生长、发育起重要作用，为脑内合成的一种碱性蛋白[14]，BDNF主要通过与酪氨酸激酶受体B结合而发挥作用，从而促进NSCs向神经元分化作用，但要将NSCs全部定向诱导成神经元不是简单的事件，可能需要许多因素的协同作用[15]。如联合表皮生长因子具有促进NSCs向神经元分化的作用，并且当表皮生长因子水平为20 μg/L、血清浓度为10%时，50 μg/L BDNF是促进NSCs分化为神经元的较佳浓度。碱性成纤维生长因子也具有增强BDNF促进NSCs向神经元分化的作用，但具体机制仍在研究中[16]。

1.5 全反式视黄酸 全反式视黄酸是维生素A(视黄醇)的衍生物，在调控多种组织和细胞的形态发生、增殖、生长发育、代谢及维持内环境稳定等方面具有广泛的生物学作用，是维持生长发育不可缺少的物质。近年来研究表明，全反式视黄酸可以抑制NSCs的增殖并且有助于诱导干细胞的分化，因其可以抵消碱性生长因子对于NSCs的促有丝分裂和分化抑制的能力，从而有助于定向诱导胚胎NSCs分化为神经元[17]。

2 物理学方法

2.1 三维空间结构 目前应用体外培养技术所获得的NSCs主要是采用“神经球”法和单层贴壁的二维培养方式，但是“神经球”法培养的NSCs聚集成神经球使培养液难以到达内部，引起内部细胞死亡，而单层贴壁法培养的细胞数目较少，所以均存在一定的缺陷[18-19]。O'Connor等[20]发现，将 NSCs接种到Ⅰ型胶原凝胶的三维支架材料中，NSCs能够增殖并分化为神经元和胶质细胞，从而实现三维培养。在三维的胶原凝胶中，NSCs可以分化为有功能的神经环路，产生的神经元具有神经元极性、神经递质、离子通道感受器及兴奋性的功能[21]。关水等[22]发现，质量浓度为 0.5 mg/L 的胶原具有良好的三维多孔结构，将NSCs接种到Ⅰ型胶原凝胶中从而实现“细胞-胶原”的三维培养，证明了NSCs在三维的胶原凝胶中能够很好地生长增殖并保持干细胞的基本特性，胶原凝胶可以作为构建NSCs的三维培养模型。由此得出，三维培养模型更利于NSCs的生存及增殖，但三维空间结构的材料多种多样，还有待于进一步研究。

2.2 力学环境 在一切的细胞微环境中都存在着一定的力学因素，在体外构建工程化组织时，给予适当的力学刺激可促进种子细胞在生物材料内的功能活动，可影响细胞的增殖、周期、骨架和分化[23]。主要包括牵张应变、剪切应力、压应力及重力。不同种类的细胞对不同的应力响应也不同，近年来研究发现，机械应力可影响 NSCs的增殖与分化[24]。黄秀玲等[25]研究发现，利用牵张应力对培养的NSCs进行力学加载，可以影响其骨架重排，从而影响细胞的功能和形态，并且通过在体外培养胚胎NSCs过程中发现，短期力学加载可促进NSCs的分化，所以有必要对其进一步研究，以发现力学因素影响NSCs的分化方向。

2.3 低氧环境 大脑齿状回颗粒区、脑室下区及海马区NSCs的神经发生可因脑缺血、缺氧而激发[26]。也有研究表明，在缺氧/缺血时，通过缺氧诱导因子系统及信号转导通路来影响EPO及其受体对中枢神经系统实现保护作用[27-30]。而低氧的培养环境也能利于NSCs向DN的分化和存活[31]。丁继固等[32]研究发现，低氧和GDNF联合作用可以互相协同增加诱导效果，对促进NSCs向DN分化有明显作用。但体外低氧如何在细胞分化中进行基因调控，并联合细胞因子发挥作用，从而在体外获得有效且足量的形态及功能成熟的DN，将进一步探讨。

3 中药诱导方法

3.1 三七总皂苷 三七总皂苷(panax notoginsenosidespns，PNS)具有很强的抗氧自由基和抗脂质过氧化作用，含人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷R1，它是三七的主要成分，药效更为突出，它能够改善脑缺氧，改善能量代谢，保护脑组织，并具有抗衰老的作用，目前已广泛应用于心脑血管疾病的治疗。近年来研究发现，PNS干预的DN移植帕金森病大鼠后移植细胞存活率明显增高，显示PNS具有抗细胞凋亡从而保护移植区DN的作用[33]。张建平等[34]也发现并初步证实了PNS在合适的剂量下能够影响体外培养的大鼠海马NSCs向神经元方向分化，其具体作用机制是否与其改善神经功能作用有关，仍有待进一步研究。

3.2 灵芝孢子粉 灵芝孢子是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来极其细小的孢子，为灵芝的生殖细胞，荟萃了灵芝的精华部分[35]。它的药理作用包括对心血管系统的保护作用，抗癌作用，延缓衰老，并且对神经系统具有镇静和保护的作用等。李艳君等[36]研究也发现，灵芝孢子粉可以调控与NSCs增殖过程密切相关的内源性神经营养因子，促进NSCs向神经元的定向诱导分化，进一步促进新生神经元轴突的生长。

3.3 其他 近年来随着中医药方面的发展，研究学者发现，中药对NSCs的分化有一定的影响作用，除上述外，还包括红景天苷、黄芩苷和丹酚酸B等，均可诱导NSCs向神经元分化，但其机制仍需进一步研究[37]。

4 结语

目前，脊髓损伤，脑出血、脑外伤、脑肿瘤术后导致的神经损伤再生修复是临床上的一大难题，NSCs分化成的神经元和神经胶质细胞为此带来了希望。但其体外NSCs的诱导分化受到多种因素的影响，如何在体外创造适合的微环境使其向神经元方向分化，并提供有效的营养因子促使其生长，是目前研究的主要问题。虽然目前体外诱导方法很多，但仍没有一种可以准确诱导NSCs向神经元方向分化的方法，所以找到可控的NSCs向神经元诱导分化的方法为临床患者带来希望，仍是未来的研究方向。

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