金黄色葡萄球菌生物被膜检测及控制方法研究进展

王 琼，唐俊妮，陈 娟，史 辉

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041）

金黄色葡萄球菌生物被膜检测及控制方法研究进展

王 琼，唐俊妮*，陈 娟，史 辉

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041）

金黄色葡萄球菌极易在食品的加工、储存过程中形成生物被膜，使得被膜内的细菌很难被清除，给食品安全带来了巨大隐患。综述了金黄色葡萄球菌生物被膜的形成、检测、控制方法和影响因素，特别是针对国内外金黄色葡萄球菌生物被膜的检测及物理、化学和生物等控制方法进行了详述，旨在为食品工业领域生物被膜的消除提供借鉴。

金黄色葡萄球菌，生物被膜，形成，检测，控制方法

细菌生物被膜是由微生物细胞以及它们分泌的保护性和吸附性的基质共同形成的三维结构的聚合物[1]。生物被膜的形成为细菌构建了一个保护性的生长环境，使细菌能够限制治疗的抗生素，以及食品工厂的消毒剂、杀菌剂等化学品的进入，并且屏蔽了寄主的免疫防御功能，使生物被膜里面的细菌不断增殖和扩散，造成持续性的慢性感染和食品反复污染[2]。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种常见的食源性病原细菌，很容易形成生物被膜，其产生的生物被膜能引起食品加工过程中能量的损耗、产品货架期的缩短，给企业带来巨大的经济损失，更严重的是影响到食品的安全性，导致食源性疾病，给消费者的健康带来危害，甚至威胁到生命安全。同时，已形成的生物被膜还有可能是其他致病菌及腐败微生物的藏身之所，生物被膜内部细菌间的群体感应使得多种细菌能够协同共生，从而增加了食品加工环境以及食品本身污染或再污染的风险，甚至引起食物中毒事件。有研究表明食品加工过程中常用设备中的不锈钢、铝等材料表面具有大量微细沟槽、缝隙等，极易残留微生物，从而可能形成生物被膜，采用机械冲洗甚至擦洗、以及消毒剂处理等方法均很难彻底清除生物被膜[3]。鉴于生物被膜形成的复杂性，为了能更好的控制生物被膜造成的危害，本文根据近年来的文献报道对金黄色葡萄球菌生物被膜的形成、检测、控制方法及影响因素等方面进行综述，旨在为食品工业领域生物被膜的消除提供借鉴。

1 生物被膜的形成

生物被膜的形成是细菌为适应自然环境而采取的一种生存策略，当细菌受到各种压力，如极端的营养缺乏或过剩，低pH，高渗透压，氧化，抗菌剂和抗生素等，细菌在接触物表面与浮游细菌相对应的一种生长方式，是由附着于惰性或活性实体的细菌细胞分泌的多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等多聚物构成胞外基质，将其自身包裹其中而形成的大量细菌聚集物[4]。这是细菌所具有的一种非常重要的环境适应机制。金黄色葡萄球菌生物被膜的形成通常涉及几个明显的阶段，包括起始的黏附，细胞与细胞之间的吸附与增殖，生物被膜的成熟以及细菌的分离与扩散等过程[5]，综合起来如图1所示。在形成生物被膜的过程当中，细菌细胞首先和支撑物表面产生瞬时的表面碰触，然后定位在其表面，最后细胞大量积累。这一过程中细菌细胞先形成单层的膜，再由单层被膜中的细菌增殖而形成三维结构完整的成熟的生物被膜[6]。金黄色葡萄球菌生物被膜生物膜的结构非常复杂，它是一系列复杂大分子的聚合体。包括多糖物质，如β-1，6-聚-N-乙酰葡萄糖胺（PNAG）或胞间黏附多糖（PIA）[7]；胞外DNA[8]（eDNA），指菌体自溶释放的胞外DNA，是生物膜基质的重要组成成分；胞外蛋白 质 和 细 胞 壁 磷 壁 酸[9]；脂 质[10]和 其 他 环 境 中 的 物质。已有研究表明金黄色葡萄球菌生物被膜基质的组成是可以根据细胞外环境变化而改变的[11]。

图1 生物被膜形成主要过程示意图Fig.1 The diagram of biofilm formation

2 生物被膜的检测

建立快速、灵敏、准确、简便的检测方法，能够有效控制由生物被膜引起的食品加工环境以及食品本身的污染或再污染，防止食源性疾病的发生。目前检测细菌生物被膜的方法有三磷酸腺苷（ATP）生物发光法，高效液相色谱法，荧光素二乙酸酯法，平板擦拭法，扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM），激光共聚焦扫描显微镜法（CLSM），银染法，结晶紫染色法，刚果红实验，报告基因检测技术，以及近年来发展的PCR鉴定，肽核酸（PNA）探针荧光原位杂交技术等[12]。其中最常用的是染色法和显微镜检法，如Christensen[13]在研究金黄色葡萄球菌在器械表面形成生物被膜时，首次应用了结晶紫染色法，此后经过不断改进，该方法目前已经成为一种廉价，直接和常用的检测细菌 生 物 被 膜 形 成 方 法 ；银 染 法[14]是 被 广 泛 采 用 的另一种定性检测生物被膜形成能力的方法，用来证明多糖蛋白复合物和细菌生物被膜的共存，样本需经AgNO3等溶液浸泡处理，这种检测方法可靠、特异、高效、省时简便，临床上可用于大量细菌生物被膜形成能力的鉴定。显微镜检法利用SEM，TEM和CLSM可以直接检测细菌生物被膜表层的形态学，对于细胞间的连结、纤维样多糖和细胞间质清楚可辨，其中CLSM是近年才发展起来的用于组织形态学研究的一项新技术，也广泛应用于实验室生物被膜的检测，它可对透光样本进行分层扫描拍摄，常用于细菌生物被膜立体结构的形态学研究[15]。另外，分子检测技术也不断在发展，Arciola等[16]通过刚果红平板法验证icaA和icaD基因只在能够形成被膜的菌株中存在，由此采用了一种简单、快捷、可靠的PCR鉴定方法来检测金黄色葡萄球菌生物被膜形成与icaA和icaD基因的关系，结果显示这种方法应用于检测金黄色葡萄球菌被膜形成是可靠的，且比传统的刚果红实验更高效。肽核酸探针荧光原位杂交技术是Malic等[17]发现的一种检测慢性伤口生物被膜菌感染的一个可靠的工具，这种技术具有良好的杂交特异性和杂交动力特性，与CLSM配合使用，探针荧光原位杂交技术还能检测和鉴定慢性伤口感染生物膜中的细菌种类立体结构及分布情况[18]。

事实上，在实际操作过程中通常是将这几种检测 技术 结 合 起 来 使 用 ，如 邢 明 勋 等[18]在 研 究 阿 奇 霉素对金黄色葡萄球菌生物被膜形成能力的实验中，通过刚果红平板法初步验证受试菌株产生生物被膜的能力，再通过结晶紫染色、银染和荧光染色结合CLSM技术，进一步观察金黄色葡萄球菌形成生物被膜的形态，证明了生物被膜在结构上存在多样性、开放性、不均一性等特点。唐俊妮[19]、黄莹莹等[20]研究则采用微孔板法来检测金黄色生物被膜形成能力，并结合SEM及CLSM对已形成的生物被膜进行形态学研究。

3 生物被膜的控制

在食品加工过程中，许多食源性病原菌易在富有养分和有机物质的固体表面黏附并形成生物被膜。这些黏附的微生物比浮游生长的细菌对消毒剂具有更强的抵抗能力。对各种化学药品（包括各种消毒剂）、加热、光照和干燥都存在耐受性，在清洗过程中，病原菌的散播会产生空气悬浮粒，然后附着在加工设备材料表面，尤其易在一些不易清洗的地方形成生物被膜，如裂纹、拐角处、垫圈、管道材料连接处等。生物被膜中的细菌被厚厚的胞外多糖蛋白复合物包绕，不易获得养分和氧气，代谢率比较低，被膜深层的细菌处于休眠状态，不进行频繁的细胞分裂，往往体积较小，对杀菌剂不敏感[3]。因此，在越来越强调食品安全的大环境下，迫使人们不得不加强研究力度去寻找控制生物被膜的方法。

3.1 物理方法

去除生物被膜常见的物理方法有超高磁场、超声波处理、高脉冲电场、低电场等[3]。杨葆华等[21]用优化的超声波平板法，利用超声波的“空化”效应，设定超声波功率135W，处理时间14min，处理温度35℃，将生物被膜从接触表面充分剥离，实验效果优于平板擦拭法。低强度的电流（Electrical Current，EC）能够增强抗菌剂对生物被膜的抗菌活性，del Pozo等[22]证明了应用EC可以增强万古霉素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀灭作用，但EC增强抗菌剂对生物被膜的清除作用因菌种和抗菌剂的不同，效果会有所改变。常压等离子体失活技术[23]，是利用高压放电在低气压状态下发生辉光放电产生活性氧和自由基来灭活微生物，该技术对细菌形成的生物被膜和浮游菌都具有杀菌作用。Niemira等[24]认为电离辐射能够有效地的杀灭生物被膜菌和浮游菌，是一种有效的物理去除生物被膜的方法，常用于处理与食品接触的卫生设备表面生物被膜相关的细菌。

3.2 化学方法

二氧化氯是一种速效、广谱、低毒的新型消毒剂，陈 秋 云 等[25]研 究 了 不 锈 钢 表 面 金 黄 色 葡 萄 球 菌生物被膜对二氧化氯的敏感性，结果显示金黄色葡萄球菌生物被膜形式比以浮游形式对二氧化氯具有更强的抵抗能力且营养物质能明显减弱二氧化氯的杀菌效果。生物被膜的形成和有机营养物质大大提高了其耐药性，对杀菌剂的杀菌效果影响很大，因此，食品加工企业在日常消毒时，一定要有效去除附于加工设备表面（尤其是死角处）的有机营养物质，选用适当的清洁剂和消毒剂，防止生物被膜形成，这样才能达到有效的消毒效果。Chaw等[26]研究表明低浓度的银离子（50μg/L）对生物膜中的细菌没有灭活能力，但离子状态的银离子可以结合在生物分子的供电子基团表面，可以减稳生物被膜基质与胞外多聚物的分子间作用力，因此，可采用协同作用方式利用银离子对生物被膜分子间作用力进行减稳。Schlag等[27]证实5mmol/L的亚硝酸盐能够抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。郭志华等[28]研究证明了0.2mmol/L的EDTA可有效抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成；EDTA只能影响金黄色葡萄球菌生物被膜形成的早期阶段；Ba2+不能完全阻断EDTA抑制生物被膜生成，Fe2+、Ca2+、Mg2+可以阻断EDTA抑制生物被膜的效应；即使是高浓度的EDTA也不能影响成熟的细胞被膜数量；EDTA能抑制细胞之间的黏附作用。

3.3 天然提取物

近年来，植物原料作为新的杀菌剂也得到广泛应用。牛至精油和其主要酚类化合物——香芹酚和百里香酚具有广泛的抗菌谱。Nostro等[29]研究表明，牛至精油和2种酚类化合物对生物被膜态的金黄色葡萄球菌的杀灭浓度分别0.25%～1.0%（v/v）和0.125%～0.500%（v/v），亚致死浓度的精油可以削弱金黄色葡萄球菌的生物被膜形成。Nostro等[30]进一步证实香芹酚能够显著降低聚苯乙烯表面的生物量和细菌黏附数，并进一步证明在其亚抑制剂量（1/2，1/4和1/8 MIC）时，酸性pH条件下香芹酚对表皮葡萄球菌生物被膜较中性pH条件下具有更高的清除作用，对生物被膜的形成也具有潜在的抑制作用。在用5%茶树油处理1h之后，不仅金黄色葡萄球菌的生物被膜被完全去除，而且其中的金黄色葡萄球菌也被杀灭[31]。王晓红等[32]研究证明了从新西兰桃柁罗汉松中提取出天然活性物质桃柁酚，可以有效减少胞外DNA（eDNA）的释放并抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成，并且抑制趋势呈剂量依赖关系，而当桃柁酚添加量为1/8× MIC药物浓度时，可以诱导生物被膜形成。此外，桃柁酚也可以通过影响Agr和Sar调控系统，作用于cidA基因进而影响eDNA释放及生物被膜的形成。

3.4 抗生素类

阿奇霉素作为一种广谱抗生素，具有免疫调节、抗微生物、抗生物被膜等作用，并且还具有良好的耐受性，成为了最常用的抗生素之一。邢明勋等[18]研究表明，阿奇霉素对金黄色葡萄球菌悬浮菌和生物被膜具有较好的抗菌活性及抗毒素作用，同时对金黄色葡萄球菌生物被膜的形成及兔红细胞的溶血活性具有显著的抑制作用，这将有助于治疗由金黄色葡萄球菌导致的感染。氨溴索（AMB）能破坏金黄色葡萄球菌已经形成的生物被膜，与万古霉素（VAN）联合应用后，可使生物被膜内金黄色葡萄球菌显著减少，显示出了协同杀菌作用[33]。低于最低抑菌浓度的黄芩苷在体外对金黄色葡萄球菌的生物被膜具有破坏作用，与左氧氟沙星联合应用，可显著增强左氧氟沙星对生物被膜的杀菌作用[12]。黄芩素能破坏耐甲氧西林金黄色葡萄球菌已形成的早期生物被膜，增强万古霉素对生物被膜内耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的清除作用，且黄芩素破坏生物被膜及其协同杀菌作用强于克拉霉素（CLR）[34]。克拉霉素可以协同抗生素增强其对生物被膜内金黄色葡萄球菌的杀菌作用。单用氧氟沙星抗菌效果并不显著，克拉霉素可明显增强其抗菌能力，二者具有协同作用，十四元环大环内酯类药物克拉霉素能够抑制生物膜，并提高氧氟沙星透过菌膜的能力，提示克拉霉素可作为控制金黄色葡萄球菌生物膜形成及相关感染的药物，应用于临床治疗此类疾病[35]。

五倍子的浓度在大于或等于0.25mg/mL时，对浮游的金黄色葡萄球菌有杀菌、抑菌的作用，但对金黄色葡萄球菌生物被膜作用不明显；当五倍子与1/4最低抑菌浓度（MIC=0.128mg/mL）的阿奇霉素联合作用后可显著减少细菌的黏附性，减少培养液和被膜中存活菌数，证明五倍子与阿奇霉素联合用药可增强对金黄色葡萄球菌生物被膜的杀菌作用[36]。然而采用抗生素也只局限于实验条件下，在实际环境中，生物被膜外面还附着有大量的细胞碎片、血小板、以及机体的各种代谢物，抗生素的作用并不能达到理想的效果，对于食品加工环境以及其他环境，这种方法并不可取。

3.5 酶类

溶葡萄球菌酶是一种最初从模仿葡萄球菌中分离获得的含Zn2+内切肽酶，对细菌胞壁肽聚糖交联结构中的五甘氨酸桥联具有特异水解作用[37]。白宁等[38]通过研究重组溶葡萄球菌酶对金黄色葡萄球菌的体外清除作用，发现不同浓度的重组溶葡萄球菌酶能够有效地减少金黄色葡萄球菌生物被膜中的活菌数。唐俊妮等[19]研究表明，耐热核酸酶和DNaseⅠ对金黄色葡萄球菌生物被膜的形成起到抑制作用。Mann等[39]发现证实了葡萄球菌核酸酶可以降解胞外DNA，促进了细胞的分散，抑制了生物被膜的形成。

3.6 食品添加剂

谢丽斯等[40]在添加低质量浓度防腐剂山梨酸钾和苯甲酸钠后，金黄色葡萄球菌成膜能力降低，当两者质量浓度均≥0.4g/L时，能够完全抑制被膜的形成，且山梨酸钾抑制成膜趋势比苯甲酸钠明显；添加质量浓度为3g/L的单甘酯时成膜率最低，而双甘酯质量浓度为4g/L成膜率最低，两者比较，在质量浓度2~4g/L范围内单甘酯抑制成膜比双甘酯好；对于蔗糖酯类乳化剂，在质量浓度0.3~4g/L范围，能显现抑制成膜作用；非离子型表面活性剂吐温-80、Span-60对金黄色葡萄球菌成膜影响不同，与两者自身亲水亲油性相关。因此，这几类食品添加剂对金黄色葡萄球菌生物被膜具有一定抑制作用。Shanks等[41]研究显示，浓度高于0.5%的柠檬酸钠，可以有效地抑制金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物被膜的形成及细胞生长，然而，对于大多数受试的金黄色葡萄球菌，亚抑菌浓度的柠檬酸钠能够显著地刺激其生物被膜的形成。Sauer等[42]用7%（w/v）柠檬酸钠缓冲液（0.24mmol/L，pH=6.2），0.05% 亚 甲 基 蓝 ，0.15% 对 羟基苯甲酸甲酯和0.015%对羟基苯甲酸丙酯制成联合杀菌剂：柠檬酸/亚甲基蓝/对羟基苯甲酸酯（citrate/ methylene blue/parabens，C/MB/P）能够显著减少金黄色葡萄球菌生物被膜形成量及生物被膜的厚度，对预成型以及成熟的生物被膜中的金黄色葡萄球菌有迅速杀灭作用，能够完全清除从生物被膜中分离的浮游态细菌。

4 其他外界影响因素

金黄色葡萄球菌具有温和的疏水性和显著的路易斯碱的性质，其在聚苯乙烯上形成被膜的最初黏附与生长基质中离子强度呈正相关。大多数菌株在37℃时较25℃时形成的生物被膜多；增加葡萄糖的量能提高被膜生成量；孵化时，NaCl和MgCl2的存在能够显著降低生物被膜形成量[43]。我们实验室通过对金黄色葡萄球菌生物被膜形成变化与外在培养条件影响关系进行研究，也证实了培养基中的糖类可以促进生物被膜的形成，NaCl对生物被膜的形成起抑制作用，并且不同的培养基在实验室条件下对被膜形成的影响具有很大差异[44]。通过改善食品接触表面的表面性质以阻止微生物在其表面上的黏附也可以作为一种控制生物被膜的途径。不同的食品接触表面形成生物被膜的能力有所不同，与玻璃和PE塑料相比，不锈钢表面黏附形成生物被膜的活菌数较多[45]。Jaglic等[46]证明在不利于微生物生长的温度（6~ 22℃）和静态条件下，会导致表皮葡萄球菌的黏附和形成生物被膜。相反，在有利于微生物生长的温度下，微生物的大量繁殖则使得黏附的细胞很容易从不锈钢表面上脱附下来。

5 结论与展望

生物被膜是一种复杂的微生境，生物被膜的形成受到菌种、菌量、接触表面类型、营养条件和生长环境等诸多因素的影响。各种不同的细菌生物被膜的形成没有一致的途径，即使是同一种细菌也没有明确的具体途径，它们可以随着环境的变化而产生相应的变化。鉴于食品加工过程中常用设备中的不锈钢、铝等材料表面具有大量微细沟槽、缝隙等，极易残留微生物，从而形成细菌生物被膜。食品生产企业应建立完整HACCP体系，确定食品生产过程中可能形成生物被膜的关键点，并对各个关键点采取适宜，高效和安全的方法进行控制。通过抑制生物被膜的形成和杀灭生物被膜中的金黄色葡萄球菌，从而降低食品中由金黄色葡萄球菌生物被膜引发的食源性疾病暴发。

随着生物信息学的发展，在研究生物被膜形成过程中越来越多的引入了生物信息学的方法，以后通过提高细菌生物被膜检测水平，建立快速灵敏准确简便的检测方法，利用芯片技术、双向电泳、有效的报告基因和基因敲除等分子技术，结合核磁共振和激光共聚焦显微技术，从基因组水平和蛋白组水平来构建生物被膜形成的分子模型，充分了解金黄色葡萄球菌生物被膜的形成机理[6]，为建立有效的生物被膜去除和预防策略奠定理论基础。

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Research progress in detection and control methods of Staphylococcus aureus Biofilm formation

WANG Qiong，TANG Jun-ni*，CHEN Juan，SHI Hui
（College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China）

Staphylococcus aureus is easy to form biofilm in food processing and storage，which makes the bacteria in the biofilm more difficult to be eradicated and brings great dangers to food safety.The biofilm formation，detection，control methods and influence factors of S.aureus were reviewed in this text，especially for the detection and physical，chemical and biological control methods.It would provide an important guidance on S.aureus biofilm elimination for food industry.

Staphylococcus aureus；biofilm；formation；detection；control methods

TS201.6

A

1002-0306（2014）22-0371-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.073

2014－03－11

王琼（1990-），女，硕士研究生，研究方向：畜产品加工与安全。

* 通讯作者：唐俊妮（1971-），女，副研究员，研究方向：食品安全。

国家自然科学基金资助项目（31071515，31371781）；教育部新世纪人才支持计划（NCET-11-0847）。