牡蛎多糖提取及其对小鼠急性酒精肝损伤的保护作用

侯 丽，汪秋宽，何云海，任丹丹，宋悦凡，姜晓东，李丽迪

（大连海洋大学，辽宁省水产品加工及综合利用重点开放实验室，辽宁大连 116023）

牡蛎多糖提取及其对小鼠急性酒精肝损伤的保护作用

侯 丽，汪秋宽*，何云海，任丹丹，宋悦凡，姜晓东，李丽迪

（大连海洋大学，辽宁省水产品加工及综合利用重点开放实验室，辽宁大连 116023）

牡蛎是我国四大养殖贝类之一，且含有丰富的糖原和多糖。利用水提醇沉法提取牡蛎多糖，通过实验研究了牡蛎多糖对小鼠急性酒精肝损伤的保护作用。实验将昆明小鼠随机平均分为6组，分别对小鼠灌胃80、160、320mg/（kg·d）不同剂量的牡蛎多糖，30d后灌胃50度乙醇造成小鼠急性肝损伤模型，以200mg/（kg·d）的联苯双酯做阳性对照，实验结束时测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性、乙醛脱氢酶（ALDH）水平及肝组织中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、乙醇脱氢酶（ADH）活性，并观察肝组织形态学变化，研究牡蛎多糖对乙醇诱导急性肝损伤小鼠的保护作用。结果表明：牡蛎多糖各剂量均能抑制肝损伤小鼠血清ALT、AST、ALDH活性的升高，且低、中、高剂量组达到显著水平，并能显著提高肝组织中SOD、ADH活性，降低MDA含量，减轻酒精对肝细胞的病理伤害。研究表明，牡蛎多糖具有保护小鼠急性酒精肝损伤的作用。

牡蛎多糖，肝损伤，肝保护

我国酒精性肝损伤的发病率逐年增加，成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病[1]。牡蛎，俗称海蛎子、蚝，属软体动物门，瓣鳃纲，异柱目，牡蛎科动物，栖息在浅海泥沙当中，是我国四大养殖贝类之一，也是世界上第一大养殖贝类[2]。其味道鲜美，营养价值丰富，是一种具有药用价值的海洋经济贝类动物，历来受世人推崇[3]。根据分析，其肉中除含有丰富的蛋白质外还存在大量的糖原和多糖，占其干重的20%～40%[4]。国内外报道了从牡蛎中提取的牡蛎多糖具有抗肿瘤、抗氧化、抗血栓及增强机体免疫功能等多种生物活性[5-8]。王俊等[6]利用热碱法提取的牡蛎多糖粗品能增强小鼠细胞免疫、体液免疫功能，并且具有一定的抗肿瘤与抗氧化作用。陈艳辉等[7]利用广西牡蛎制备出的牡蛎多糖在一定浓度下对鼻咽癌细胞CNE-1和血管内皮细胞的生长增殖具有抑制作用。李志等[8]研究表明牡蛎多糖在体外可抑制自由基的损伤，另外他们还通过小鼠实验证明牡蛎多糖能影响免疫细胞的生成，增强机体非特异性细胞免疫，从而达到正向免疫调节。牡蛎多糖的多种生理功能已引起广大研究者的广泛兴趣，有关研究工作已取得较大进展，但牡蛎多糖对小鼠急性酒精肝损伤保护作用的研究报道较少。本实验以牡蛎为材料制备牡蛎多糖，并研究了牡蛎多糖对酒精诱导的急性肝损伤小鼠的保护作用，进一步研究牡蛎的药用价值，为深入开发海洋药用资源打下基础[7]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牡蛎 大连黑石礁市场；昆明种小鼠 60只，雄性（22±2）g，大连医科大学实验动物中心提供，动物检验合格证号：SCXK（辽）2008-0002；联苯双酯（DDB） 北京协和药厂产品（批号11090205）；血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定试剂盒（批号20130413）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）测定试剂盒（批号20130413）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（批号20130413）、超 氧 化 物 歧 化 酶（SOD）测 定 试 剂 盒（批号20130415）、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒（批号20130415）、乙 醇 脱 氢 酶（ADH）测 试 盒（ 批 号20130417）、乙醛脱氢酶（ALDH）酶联免疫分析试剂盒（批号20130416） 均购于南京建成生物工程公司；牛血清蛋白 上海浦江生物化学研究所；葡萄糖标准品 东北制药总厂一分厂产品；实验用其他试剂 均为分析纯。

原子吸收分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；UV-754分光光度计 上海康华生化仪器制造厂；LD5-2A离心机 北京医用离心机厂；HH-4数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

1.2.1.1 牡蛎粗多糖的制备 新鲜牡蛎肉匀浆后，准确称取1kg后，加入1L 95%乙醇，在常温下搅拌1.5h，静置、4900r/min离心15min后，取沉淀部分，加入1L去离子水于90℃水浴中浸提2h后，冷却、静置，4900r/min离心15min，收集上清液，并将沉淀部分重复提取一次，合并滤液。调节pH4.6，4900r/min离心15min收集上清液，加入酒精至酒精浓度为70%，4900r/min离心15min，取沉淀后，真空冷冻干燥后得牡蛎多糖粗提物[8-12]。

1.2.1.2 牡蛎粗多糖成分及重金属含量的测定 总糖 含 量 的 测 定 依 照 苯 酚 硫 酸 法[13]，蛋 白 质 含 量 的 测定方法为福林酚试剂法[14]，水分含量测定参照GB/T 5009.3-2003，用直接干燥法测定水分含量[15]，重金属含量的测定为原子吸收法[16-19]。

1.2.2 牡蛎多糖对肝损伤的保护作用

1.2.2.1 模型制备及给药 将小鼠按体重随机分组，分别为空白对照组，空白模型组，联苯双酯阳性对照组 ，牡 蛎 多 糖 低（80mg/kg·d）、中（160mg/kg·d）、高（320mg/kg·d）剂量组，共6组，每组各10只。给药组每天灌胃给药1次，连续30d，空白对照组与空白模型组给予同体积生理盐水，牡蛎多糖剂量组给予蒸馏水溶解的牡蛎多糖，于末次给药后1h，对照组灌胃生理盐水，其余每组均按12mL/kg经口灌胃50度乙醇。禁食24h后，摘除眼球取血，离心后取上层血清。快速处死小鼠取肝脏，并在肝左叶组织相同部位取约0.3g，放冰冷的生理盐水中漂洗，滤纸拭干，用组织匀浆器制成10%肝组织匀浆，备测。

1.2.2.2 生化指标检测与病理学检查 血清ALT、AST、ALDH的活性，肝组织MDA的含量、SOD、ADH的活性以及肝组织中的蛋白含量均按试剂盒要求进行测定。处死小鼠后，取肝右叶组织，用10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，苏木精一伊红（HE）染色，在显微镜下进行病理学观察。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 牡蛎多糖总糖、水分、蛋白质、重金属含量

测定结果表明，牡蛎多糖粗品提取率为15.389%（干基），牡蛎多糖纯度为81.23%，水分含量8.15%，蛋白质10.02%。重金属Pb 0.46mg/kg，Cr 0.25mg/kg，Cd 0.08mg/kg，Cu 9.1mg/kg，无机砷含量未检出，均符合国标GB/T 2733-2005和 GB/T 2762-2005要求[20-21]。

表1 牡蛎多糖对小鼠血清ALT、AST、ALDH活性的影响（±S，n＝10）Table 1 Result of ALT，AST and ALDH activities of mice serum inhibitied by oyster polysaccharide（±S，n＝10）

表1 牡蛎多糖对小鼠血清ALT、AST、ALDH活性的影响（±S，n＝10）Table 1 Result of ALT，AST and ALDH activities of mice serum inhibitied by oyster polysaccharide（±S，n＝10）

注：与正常对照组相比，a：p<0.05，b：p<0.01；与正常模型组相比，c：p<0.05，d：p<0.01；与药物对照组相比，i：p<0.05，j：p<0.01；表2同。

组别 剂量（mg/kg·d） ALT（U/L） AST（U/L） ALDH（μmol/L）正常对照组 － 8.18±4.05d 11.52±4.17d 1.84±0.28dhj正常模型组 － 31.12±1.47bhj 37.74±3.94bhj 7.57±1.83bhj药物对照组 200 9.32±3.88d 14.50±2.33d 3.13±0.79bd牡蛎多糖低剂量组 80 8.82±4.97d 13.76±7.23d 3.16±1.12bde牡蛎多糖中剂量组 160 7.97±3.48d 12.34±2.49dg 2.71±0.33bd牡蛎多糖高剂量组 320 7.79±4.54d 13.91±3.46de 2.44±0.49bd

2.2 牡蛎多糖对小鼠血清ALT、AST、ALDH活性的影响

由表1可知，与正常对照组相比，模型组的小鼠血清ALT、AST及ALDH活性显著上升，表明已成功构建肝损伤模型。牡蛎多糖各剂量组的小鼠血清ALT和AST活性都显著低于正常模型组（p＜0.05），说明各剂量都具有显著降低小鼠血清ALT和AST活性的作用，且低、中、高各剂量组均优于联苯双酯组。与正常模型组相比，牡蛎多糖各剂量组的小鼠肝脏ALDH活性都显著下降，说明多糖各剂量都具有显著降低小鼠肝脏ALDH活性的作用。

表2 牡蛎多糖对小鼠肝脏MDA含量、SOD、ADH活性及肝脏指数的影响（±S，n＝10）Table 2 Effect of oyster polysaccharide on liver index,content of MDA，SOD and ADH activities of mice liver（±S，n＝10）

表2 牡蛎多糖对小鼠肝脏MDA含量、SOD、ADH活性及肝脏指数的影响（±S，n＝10）Table 2 Effect of oyster polysaccharide on liver index,content of MDA，SOD and ADH activities of mice liver（±S，n＝10）

组别 剂量（mg/kg·d） MDA（nmol/mgprot） SOD（U/mgprot） ADH（U/mgprot） 肝脏指数（mg/g）正常对照组 － 1.95±0.46di 161.80±23.93dhi 27.19±7.93d 36.81±7.04dhi正常模型组 － 3.51±0.45bhj 119.87±4.56b 18.38±5.80bh 45.62±4.87p药物对照组 200 2.66±0.48dg 129.33±10.31c 24.11±15.04c 43.65±2.87b牡蛎多糖低剂量组 80 2.34±0.48dgi 110.62±22.37ad 39.23±11.26bdi 40.98±6.28a牡蛎多糖中剂量组 160 2.49±0.33dg 122.51±10.37c 36.26±7.95bdi 42.27±3.62bg牡蛎多糖高剂量组 320 2.20±0.21di 123.76±26.92c 25.74±7.14c 42.43±1.90bh

2.3 牡蛎多糖对小鼠肝脏MDA含量、SOD和ADH活性及肝脏指数的影响

由表2可知，与正常对照组相比，模型组的小鼠肝脏组织中的MDA含量显著上升，SOD、ADH活性显著下降，表明已成功构建肝损伤模型。牡蛎多糖各剂量组的小鼠肝脏组织中的MDA含量都显著低于正常模型组，说明各剂量都具有显著降低小鼠肝脏组织中的MDA水平的作用，牡蛎多糖低、中、高各剂量组均优于联苯双酯组，其中牡蛎多糖低、高剂量组显著优于联苯双酯组（p＜0.05）。牡蛎多糖中、高剂量组的小鼠肝脏组织中的SOD含量均高于正常模型组，说明牡蛎多糖中、高剂量组有升高小鼠肝脏组织中的SOD水平的作用。牡蛎多糖各剂量组的小鼠肝脏组织中的ADH活性都显著高于正常模型组，说明各剂量组都具有显著升高小鼠肝脏组织中的ADH活性的作用，且牡蛎多糖各剂量组均优于联苯双酯组，且牡蛎多糖低、中剂量组与联苯双酯组存在显著性差异（p＜0.05）。对于肝脏指数，各剂量组均低于模型组，且均低于联苯双酯组。

2.4 牡蛎多糖对酒精肝损伤组织学影响

由图1可见，在400×光镜下，正常组织肝小叶结构清晰，肝细胞索状排列规则，肝细胞结构及形态正常[21]。而空白模型组肝细胞发生肿胀现象，肝细胞索紊乱，细胞界限不清，有气球样变细胞，并伴有炎症细胞浸润现象。经过牡蛎多糖组预处理过的小鼠肝细胞索排列整齐，细胞形状基本规则，有少量炎症细胞浸润[22]。光镜检查结果表明，牡蛎多糖能明显减轻酒精对肝组织的急性损伤。

3 讨论

酒精（主要成分乙醇）进入机体后，约90%在肝脏内氧化，而肝脏是人体含酶最丰富的脏器，当肝脏有实质性损害时血清某些酶活性可升高。例如转氨酶是人体代谢过程中必不可少的酶，当肝细胞受损伤时，转氨酶被释放到血液中，使血清转氨酶升高。因此，转氨酶在血清中活力高低反映了肝脏的受损伤程度。另外氧化应激是酒精性肝损伤最重要的发病 机 制 之 一[22]，其 中 氧 自 由 基 在 酒 精 性 肝 病 的 发 生中起着重要作用。MDA是机体脂质过氧化作用产生的终产物，可引起细胞代谢及功能障碍甚至死亡，可以衡量组织过氧化损伤的程度MDA是脂质过氧化物的最终代谢产物，其含量的高低可反映机体的脂质过 氧 化 程 度 ，从 而 反 映 肝 脏 细 胞 损 伤 的 程 度[23]。 而SOD是是细胞内抗脂质过氧化作用的酶性保护系统的主要成分，可以保护细胞免受损伤，SOD水平的高低是衡量机体对抗氧自由基能力大小的重要因素，是反应机体抗氧化能力的重要指标，ADH（乙醇脱氢酶）和ALDH（乙醛脱氢酶）是酒精在体内代谢的关键酶，乙醇经ADH催化氧化成乙醛，乙醛再经过ALDH催化氧化成乙酸，后者以乙酰CoA的形式进入三羧酸循 环 ，最 后 氧 化 成CO2和H2O排 出 体 外[24]。 因 而 测 定ALT、AST、MDA、SOD、ADH、ALDH的变化可初步反映肝损伤的程度[24-25]。

图1 牡蛎多糖对肝损伤小鼠肝组织的病理学影晌（HE染色，400×）Fig.1 Effect of Oyster Polysaccharide on histopathological changes that occurred in mice during alcohol intoxication（dyeing by hematoxylin and eosin，400×）

4 结论

很多牡蛎提取物对于肝损伤都有一定的修复和保护作用，如张翠萍等[23]研究结果表明，牡蛎肝宝能有效降低肝组织中丙二醛含量并提高组织中还原性谷胱甘肽的含量，这与牡蛎肝宝中的牛磺酸和糖原等有关。而本实验中牡蛎多糖运用水提醇沉法，70%乙醇沉淀只针对大分子物质例如多糖等，其中的牛磺酸、糖原等小分子物质一般不会被70%乙醇沉淀。因此本实验结果表明，牡蛎多糖具有降低肝损小鼠血清ALT、AST、ALDH活力，并能显著提高肝组织中SOD、ADH活力、降低MDA含量的能力。在光学显微镜下观察了肝组织的形态学改变，其结果与所测得的生化指标一致，均表明牡蛎多糖具有一定的保护肝脏的作用。其作用机制可能是提高了肝细胞的抗氧化能力，保护肝细胞膜结构的完整及功能，而达到一定程度上拮抗酒精对肝细胞的损害作用，该机制有待进一步研究。

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The extraction of oyster polysaccharide and its hepatoprotective effect against alcohol-induced hepatic injury in mice

HOU Li，WANG Qiu-kuan*，HE Yun-hai，REN Dan-dan，SONG Yue-fan，JIANG Xiao-dong，LI Li-di
（The Key and Open Laboratory of Fishery Product Processing and Utilization of Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

Oyster polysaccharide was prepared from ostrea gigas thunberg by water extraction and alcohol precipitation.The hepatoprotective effect of oyster polysaccharide against alcohol-induced hepatic injury in mice was studied.The Kunming mice were oral administration daily with oyster polysaccharides at three doses of 80，160，320mg/kg respectively for 30 days.Then liver injury model was established by administration of 50 degrees intragastric ethanol in mice on the 30th day.The positive control was administrated with 200mg/kg dimethyl diphenyl bicarboxylate.The activities of serum ALT，AST and ALDH，the content of MDA and the activity of SOD，ADH in hepatic tissue were measured.The hepatic histological changes were observed by optical microscope.The results showed that oyster polysaccharides had significantly hepatoprotective activity on alcohol induced liver damage in mice．The serum AST，ALT，ALDH and liver lipid peroxides in mice administrated with oyster polysaccharides decreased significantly compared with those of experiment control．The contents of MDA and ADH in hepatic tissue were also decreased while the activities of SOD increased significantly for the mice with oyster polysaccharides compared with those of experiment control.Histopathological changes induced by alcohol were also significantly reduced by oyster polysaccharides treatment．The results indicated that oysters polysaccharides had a protective role in acute alcoholic liver injury in mice.

oyster polysaccharide；hepatoprotective effect；hepatic injury

TS254.1

A

1002-0306（2014）22-0356-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.070

2014－03－17

侯丽（1987-），女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

* 通讯作者：汪秋宽（1962-），女，硕士研究生，教授，研究方向：水生生物资源利用。

辽宁省优秀人才计划项目。