Nisin和柠檬酸对鲜切皇冠梨储藏期间单增李斯特菌生长的影响

陈 晨，胡文忠，*，何煜波，姜爱丽，张瑞东

（1．大连民族学院生命科学学院，生物化学工程国家民委-教育部重点实验室，辽宁省食源性病原微生物快速检测与控制工程技术研究中心，辽宁大连 116600；2．大窑湾出入境检验检疫局，辽宁大连 116600）

Nisin和柠檬酸对鲜切皇冠梨储藏期间单增李斯特菌生长的影响

陈 晨1，胡文忠1，*，何煜波1，姜爱丽1，张瑞东2

（1．大连民族学院生命科学学院，生物化学工程国家民委-教育部重点实验室，辽宁省食源性病原微生物快速检测与控制工程技术研究中心，辽宁大连 116600；2．大窑湾出入境检验检疫局，辽宁大连 116600）

分别采用0.05mg/mL乳酸链球菌素（Nisin）、0.3%柠檬酸复配溶液和自来水清洗接种单增李斯特菌（LM）的鲜切皇冠梨，将清洗后的鲜切皇冠梨分别于4、12、24℃的条件下储藏，以未清洗的样品为对照，测定储藏过程中LM的生长情况。结果显示Nisin和柠檬酸清洗能显著降低（p＜0.05）鲜切皇冠梨中LM的初始带菌量。在4℃储藏过程中，Nisin和柠檬酸清洗的鲜切皇冠梨中LM数量没有明显变化（p＞0.05），自来水清洗和未清洗的鲜切样品中LM数量略有升高。在12℃和24℃储藏期间，三种处理方式的鲜切皇冠梨LM数量均显著上升（p＜0.05）。Nisin和柠檬酸复配清洗处理结合低温储藏能有效控制鲜切皇冠梨中LM的生长。

单增李斯特菌，鲜切皇冠梨，乳酸链球菌素，柠檬酸，储藏

鲜切果蔬自20世纪50年代问世后，因其品质新鲜、营养卫生和食用方便等优点而得到较快发展。但是由于鲜切果蔬的加工操作（如去皮、切割及切片等）会使果蔬的组织结构破坏、营养成分外流，极有利于微生物生长繁殖，在一定程度上降低了鲜切果 蔬 的 安 全 性[1]。 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌（Listeria monocytogenes，LM）是一种常见的人和畜共患病食源性致病菌，可以通过污染的畜禽产品、蔬菜、水果等食物而引起人类感染致病[2]，近年来在鲜切果蔬中常检测出LM的存在[3-6]。由于鲜切果蔬在食用前不再进行杀菌处理，因此在鲜切果蔬加工过程中进行必要的杀菌处理和选用适宜的储藏条件，对于保证其食品安全具有重要作用[7]。

目前在鲜切果蔬微生物控制中，含氯杀菌剂因其价格低廉、杀菌迅速而广泛应用，但很多含氯杀菌剂的安全性问题也不容忽视。Nisin和柠檬酸是被认为安全的（Generally Recognized as Safe，GRAS）食品抗菌剂，现阶段利用Nisin和柠檬酸来控制鲜切果蔬中LM的研究较多[8-11]，但采用Nisin和柠檬酸复配清洗鲜切皇冠梨，探讨储藏温度对清洗后鲜切皇冠梨中LM生长影响的研究未见报道。本文采用0.05mg/mL Nisin和0.3%柠檬酸复配溶液和自来水清洗接种单增李斯特菌（LM）的鲜切皇冠梨，将清洗后的鲜切皇冠梨分别于4、12、24℃的条件下储藏，以未清洗的样品为对照，研究清洗剂及储藏温度对鲜切皇冠梨中LM生长的影响，为探索鲜切果蔬的储藏保鲜提供新的方法和思路。

1 材料方法

1.1 材料与仪器

皇冠梨 购于大连开发区乐购超市；LM标准菌株（ATCC19115） 辽宁省疾病控制中心；含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）、牛津琼脂（OXA）基础、牛津琼脂（OXA）添加剂 青岛海博生物技术有限公司；蛋白胨 北京陆桥技术有限责任公司；乳酸链球菌素（Nisin） 浙江银象生物工程有限公司；柠檬酸 为食品级。

MLS-3020型全自动高压蒸汽灭菌器 日本SANYO公司；1300系列A2型二级生物安全柜 美国THERMO FISHER SCIENTIFIC 公 司 ；AB135-S 型 分析 天 平 瑞 士METTLER TOLEDO公 司 ；BagMixer-400W型均质器 法国INTERSCIENCE公司；DNP-9052型电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；HYC-326A型医用冷藏箱 青岛海尔特种电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原菌液的制备 在无菌室的生物安全柜内无菌操作取标准LM菌株，在TSA-YE无菌平板上平行划线活化，36℃培养24~48h后挑取单菌落接种到含有150mL无菌TSB-YE的三角瓶中，充分混匀后于36℃培养箱中培养24~48h，至初始菌落数大致为107cfu/mL，即原菌液，4℃保存，备用。

1.2.2 接种菌液的制备 原菌液在4℃、5000r/min条件下离心5min后，弃去上清，沉淀用0.1%蛋白胨水冲洗，重复两次后沉淀用0.1%蛋白胨水适当稀释，得到浓度约为107cfu/mL的菌悬液，即接种菌液，4℃保存备用[12]。

1.2.3 样品制备 在无菌室内，将皇冠梨用自来水洗净后，用无菌刀将其切成约1cm×1cm×1cm的小块，每30g鲜切皇冠梨样品接种0.1mL接种菌液，接种后，样品于生物安全柜中干燥30min。

1.2.4 样品处理与储藏 干燥后的鲜切皇冠梨分别放入含有自来水和0.05mg/mL Nisin、0.3%柠檬酸复配溶液的烧杯中，固液比为1∶5，手动搅拌浸泡5min，取出样品置于生物安全柜内干燥20min。将清洗干燥后的鲜切皇冠梨利用无菌均质袋封口包装后，分别置于（4±2）、（12±2）、（22±2）℃的温度下储藏。未清洗的鲜切皇冠梨作为对照在同样的条件下储藏。

1.2.5 单增李斯特菌计数 采用平板计数法[2]。在4℃条件下储藏的鲜切皇冠梨分别于第0、1、2、3、4、5d取样，在12℃和24℃条件下储藏的鲜切样品分别于第0、4、12h和1、2、3、4、5d取样。将取出的样品置于无菌均质袋中，加入50mL 0.1%蛋白胨水，在拍击式均质机上连续均质1min，上清菌悬液选择合适稀释度用无菌生理盐水进行稀释，取100μL的稀释液涂布于牛津琼脂（OXA）平板上，36℃培养48h后计数。每个处理做3个平行实验。

1.3 数据处理

实验数据采用SPSS 17.0软件进行方差分析和差异显著性检验，用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 4℃ 储 藏 条 件 下 Nisin 和 柠 檬 酸 对 鲜 切 皇 冠 梨LM生长的影响

图1 4℃储藏条件下LM生长情况Fig.1 Fate of LM on fresh-cut pears strorage at 4℃

图1表示Nisin和柠檬酸复配清洗以及自来水清洗后的鲜切皇冠梨在4℃条件下储藏过程中LM的生长情况。由图1可知，自来水清洗使鲜切皇冠梨中LM的数量与未清洗组仅下降了0.4lg cfu/g，而Nisin和柠檬酸复配清洗处理后，鲜切皇冠梨中LM的初始带菌量与未清洗组下降了2.1lg cfu/g。在4℃条件下储藏过程中，Nisin和柠檬酸复配清洗处理的鲜切皇冠梨中LM的数量没有发生明显变化（p＞0.05），而自来水清洗和未清洗的鲜切皇冠梨中LM则略有上升（p＜0.05）。

2.2 12℃ 储 藏 条 件 下Nisin和 柠 檬 酸 对 鲜 切 皇 冠 梨LM生长的影响

由图2所示，三种处理方式下的鲜切皇冠梨在12℃条件下储藏过程中LM数量均显著升高（p＜0.05）。自来水清洗和未清洗的鲜切皇冠梨中LM在储藏过程中一直呈上升趋势，未清洗的样品在储藏过程中LM的数量从初始的4.6log cfu/g（第0d）上升至5.9log cfu/g（第5d）。虽然自来水清洗能使LM的数量有所下降，但在储藏3d后LM的数量与未清洗的样品无显著差异（p＞0.05）。Nisin和柠檬酸复配清洗处理的鲜切皇冠梨中LM在储藏的最初3d内上升了2lg cfu/g，随后储藏过程中LM的数量并没有发生显著变化（p＞0.05），储藏至第5d时，LM的数量达到4.5lg cfu/g。在12℃储藏过程中，Nisin和柠檬酸复配清洗处理样品中LM的数量显著低于自来水清洗和未清洗的样品（p＜0.05）。

图2 12℃条件下储藏LM生长情况Fig.2 Fate of LM on fresh-cut pears strorage at 12℃

2.3 24℃ 储 藏 条 件 下Nisin和 柠 檬 酸 对 鲜 切 皇 冠 梨LM生长的影响

不同处理方式的鲜切皇冠梨在24℃条件下储藏期间LM数量的变化如图3所示。从图3中可以看出，未清洗样品中LM的生长情况与自来水清洗的样品基本一致。自来水清洗的鲜切皇冠梨储藏5d后，LM的数量上升了2.1lg cfu/g，其中储藏的第1d LM生长速度较快，从第2~5d，LM的数量无显著变化（p＞0.05）。Nisin和柠檬酸复配清洗处理的鲜切皇冠梨中LM在储藏的最初3d内生长速度较快，随后保持不变（p＞0.05）。储藏5d后，LM的数量达到了4.7lg cfu/g，要显著低于自来水清洗和未清洗样品中LM的数量（p＜0.05）。

图3 24℃储藏条件下LM生长情况Fig.3 Fate of LM on fresh-cut pears strorage at 24℃

3 讨论

鲜切果蔬的清洗处理是影响其微生物生长的重要因素。许多研究表明单纯自来水清洗并不能控制鲜 切果 蔬中LM的生 长[13-14]，而 在 清 洗 用 水 中 加 入 杀菌剂能够有效抑制致病微生物数量的升高。Park等[15]采用1%和2%的柠檬酸处理鲜切苹果10min，能显著抑制其中大肠杆菌O157∶H7、沙门氏菌和LM的生长，此外柠檬酸的处理还能降低鲜切苹果的褐变程度。Xu等[11]研究表明，单独使用Nisin并不能使鲜切黄瓜和生菜中的LM数量显著降低，而当Nisin与柠檬酸以及葡萄籽提取物复配使用时则能显著降低LM的数量。本研究采用0.05mg/mL Nisin与0.3%柠檬酸复配溶液清洗鲜切皇冠梨5min，使LM的初始菌量下降了2.1lg cfu/g，在4℃条件下储藏5d，LM数量没有发生显著变化。但是在12℃和24℃的条件下储藏，LM生长速度较快。可能是因为Nisin和柠檬酸处理使鲜切皇冠梨中内源性微生物的数量下降，使LM失去了生长竞争抑制，从而增加了生长速度[16-17]。

储藏温度也是影响鲜切果蔬中微生物生长的重要因素。LM具有低温存活生长性，可以在2～4℃条件下生长[18]。Fang等[18]研究显示，鲜切哈密瓜中的LM可以在4℃的条件生长，接种到桃子中的LM在5℃条件下6d，数量可以增加0.5lg cfu/g[19]。但是也有一些研究表明鲜切果蔬在低温条件下储藏LM的数量不变或有所下降，例如Vandamma等[12]研究结果表明，鲜切芹菜在4℃的条件下储藏7d，LM的数量下降了1lg cfu/g；绿芦笋和鲜切生菜中LM在4℃的条件储藏不生长[20-21]。本研究表明，Nisin和柠檬酸处理后的鲜切皇冠梨在4℃储藏过程中LM的数量没有发生明显变化。这些研究结果的不一致主要与鲜切产品中内源微生物的种类和数量以及鲜切产品的营养成分、pH等因素有关。随着储藏温度的升高，LM的增长速度加快。Alegre等[22]将鲜切苹果在25℃和20℃条件下储藏2d英诺克李斯特菌的数量增长了两个对数值，而在10℃条件下储藏6d才能达到这一增加量，这与本研究中鲜切皇冠梨在24℃条件下储藏LM增长的数量要高于12℃条件下储藏的增长量的结果一致。

4 结论

本研究的结果表明清洗溶液成分、储藏温度对鲜切皇冠梨中LM的生长均具有一定影响，Nisin和柠檬酸清洗处理结合低温储藏能够有效控制鲜切皇冠梨中LM的生长。

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Effect of Nisin and citric acid on the fate of Listeria monocytogenes on fresh-cut crown pears during storage

CHEN Chen1，HU Wen-zhong1，*，HE Yu-bo1，JIANG Ai-li1，ZHANG Rui-dong2
（1.College of Life Science，Dalian Nationalities University，Key Laboratory of Biochemical Engineering，The State Ethnic Affairs Commission-Ministry of Education，Research Center of Engineering and Technology for Rapid Detection of Foodborne Microorganisms and Control，Dalian 116600，China；2.Dayaowan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dalian 116600，China）

Sanitizer solution （0.05mg/mL Nisin+0.3%citric acid ） and tap water were separately used to wash fresh-cut crown pears inoculated with Listeria monocytogenes（LM）.Washed fresh-cut samples were stored at 4，12 and 24℃ for 5 days to determine the fate of LM during storage，unwashed samples were used as control. The results showed that washing with Nisin combined with citric acid solution significantly reduced the initial level of LM （p ＜0.05）.LM populations remained relatively unchanged （p ＞0.05 ） on sanitizer solution washed fresh-cut samples and small increased on tap water washed and unwashed samples during storage at 4℃ . When storage at 12 and 24℃ ，LM populations significant increased （p＜0.05） on the fresh-cut pears.Results indicated that washing with Nisin and citric acid combined with storage at a refrigeration temperature might be applied as an effective preservative for controlling the growth of LM on fresh-cut crown pears.

Listeria monocytogenes；fresh-cut crown pears；Nisin；citric acid；storage

TS201.3

A

1002-0306（2014）22-0326-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.063

2014－01－20

陈晨（1986-），女，博士，讲师，研究方向：食品质量与安全。

* 通讯作者：胡文忠（1959-），男，博士，教授，研究方向：采后生物学与技术。

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD38B05）；国家

自然科学基金资助项目（31172009）；大连市科技计划项目（2012E13SF106）；大连民族学院博士启动基金项目（0701-110014）；中央高校基本科研业务费项目（DC2013010107）。