脉冲强光对糙米发芽过程积累GABA条件的优化

王 勃，马 涛，惠丽娟，刘 贺，何余堂

（渤海大学化学化工与食品安全学院，渤海大学粮油科学与技术研究所，辽宁锦州 121013）

脉冲强光对糙米发芽过程积累GABA条件的优化

王 勃，马 涛，惠丽娟，刘 贺，何余堂

（渤海大学化学化工与食品安全学院，渤海大学粮油科学与技术研究所，辽宁锦州 121013）

通过脉冲强光技术促进糙米发芽过程富集GABA，并采用响应面方法确定了其最佳处理条件：浸泡12h后，对单层糙米进行脉冲强光照射，单次能量400J、闪照次数277次、闪照距离11.3cm，此条件下发芽糙米中GABA含量可达到345.7mg/100g。

发芽糙米，GABA，脉冲强光，响应面

糙米具有完整的生命活力，在适宜水分和温度条件下就能发芽[1]。在糙米发芽过程中GABA在磷酸吡 哆 醛（PLP）等 辅 酶 作 用 下[2]，经 谷 氨 酸 脱 羧 酶（GAD）催化L-谷氨酸（L-Glu）脱羧生成，而谷氨酸的生成依靠蛋白酶分解蛋白质，然后经谷氨酸代谢转化得到。发芽糙米中γ-氨基丁酸（GABA）含量与GAD的活性大小呈显著正相关[3]。在机械损伤、温度应激、高酸度、厌氧、干旱、黑暗和虫害等逆境条件下，植物体内GAD的活性升高，导致GABA积累，积累的GABA反过来则会刺激细胞，加大植物体对逆境的适应，这是植物在抵抗昆虫斗争、组织受损和温度胁迫等逆境中的重要应激反应。研究表明[4]，虫害、挤压、研磨等机械损伤，微波、红外、冷冻等温度应激的逆境条件都会导致胞内结构破坏，使细胞质pH降低、钙离子水平增加，使得与CaM相关的基因表达在环境应激中受到调节，从而激活谷氨酸脱羧酶引起GABA含量的增加。脉冲强光的波长范围从紫外光到近红外光，其中至少有70%的电磁能来自波长为170～2600nm的光线，具有光热、光化学效应[5]。脉冲强光处理脉冲电场所产生的物理效应对GAD活性有促进作用，因此对富集GABA有一定促进作用。本研究在单因素实验基础上，进行响应面设计，得出脉冲强光处理发芽糙米富集GABA最佳工艺条件，为实际生产提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试糙米 中稻股份有限公司，品种为辽星1号；GABA标准品 Sigma公司；谷氨酸钠（MSG，味精，谷氨酸钠＞99%，无盐） 中外合资武汉味全食品有限公司；次氯酸钠 分析纯，有效氯为9%，广东汕头市西陇化工厂；重蒸苯酚 分析纯，武汉天源生物技术有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硼砂、硼酸和无水乙醇 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

脉冲强光表面杀菌实验柜 宁波中物光电杀菌技术有限公司；HH.B11-500电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；HH-601A超级恒温水浴锅 江苏省金坛市医疗仪器厂；UV1200型紫外可见分光光度计 上海正慧工贸有限公司；PB-20标准pH计 北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发芽糙米的生产工艺流程 将精选后的糙米用1.0%的次氯酸钠溶液浸泡5min，加入量以刚好淹没糙米为宜，下同[6]，自来水冲洗3遍，加入4倍体积的水，30℃浸泡12h。糙米浸泡后用去离子水清洗，均匀地摊于铺有四层纱布的培养皿中，其中纱布用营养液润湿[7]。所用营养液为pH5.7的PBS缓冲溶（0.05mol/L），其中MSG浓度为2.1mg/mL。发芽过程每隔4h加入1mL营养液并上下翻动糙米，以保证糙米在发芽期间的湿润状态，31℃恒温发芽25h。

1.2.2 脉冲强光参数介绍 工作电压2800V，额定功率1kW，电源：AC220V±10%，内置石英板调节照射距离，共有六个高度可以调节。样品辐照腔规格：480（mm）×400（mm）×270（mm）。处理时，将处理样品置于灯管正下方石英板上即可。在闪照过程中，上下翻动糙米，使其照射均匀。

1.2.3 GABA含量的测定 参考姚森[8]的方法并加以改进，取2.5g发芽糙米，加适量蒸馏水研磨匀浆，然后定容至50mL，于30℃水浴中浸提2h，过滤后取滤液0.5mL，加入0.2mL 0.2mmol/L硼酸缓冲液（pH9.0），1mL 6g/100mL重蒸苯酚溶液，0.4mL有效氯含量9%的NaClO溶液，充分振荡，置于沸水浴10min，再立即置于冰水浴中20min并不断振荡，待溶液出现蓝绿色后，加2mL体积分数60%的乙醇溶液，再次振荡均匀，静置后于645nm波长处比色，测定其吸光度值A，通过GABA的标准曲线Y=0.1819X-0.0058（Y为GABA的浓度，mg/mL；X为A645，R2=0.998）求出GABA含量。

1.2.4 单因素实验 考察脉冲强光单次能量、闪照次数、开始处理时间、物料厚度及闪照距离5个因素对糙米GABA的影响[9]。

1.2.4.1 单次能量对发芽糙米GABA含量的影响 糙米浸泡后，将单层糙米分别在单次能量为100、200、300、400、500J条件下闪照300次处理，闪照距离为11.3cm，以无脉冲强光处理为对照组，其他过程同“1.2.1”，以GABA含量为考察指标，下同。

1.2.4.2 闪照次数对发芽糙米GABA含量的影响 糙米浸泡后，将单层糙米在单次能量为400J条件下分别闪照100、200、300、400、500次处理，闪照距离为11.3cm，以无脉冲强光处理为对照组。

1.2.4.3 物料厚度对发芽糙米GABA含量的影响 将8、16、32g浸泡后的糙米（实验中发现，刚好铺满培养皿所需糙米为8g左右）均匀铺满培养皿，视其料层厚度分别为1、2、4层，在单次能量为400J条件下闪照300次处理，闪照距离为11.3cm，以无脉冲强光处理为对照组，在处理过程中，适当翻动糙米，使其照射均匀。

1.2.4.4 闪照距离对发芽糙米GABA含量的影响 糙米浸泡后，将单层糙米在单次能量为400J条件下闪照300次处理，闪照距离分别为9.5、10.4、11.3、12.2、13.1、14.0cm，以无脉冲强光处理为对照组。

1.2.4.5 开始处理时间对发芽糙米GABA含量的影响 分别将浸泡前、浸泡后、发芽12h时的单层糙米在单次能量为400J条件下闪照300次处理，闪照距离为11.3cm，以无脉冲强光处理为对照组。

1.2.5 实验条件优化 根据单因素实验结果，由于物料厚度与GABA富集效果呈负相关，因此选取物料为8g，浸泡后进行脉冲强光处理效果明显优于其他处理方法，因此选取浸泡后进行脉冲强光处理。因此将单次能量（A）、闪照次数（B）、闪照距离（C）三个因素与发芽糙米中GABA含量进行响应面实验设计，优化糙米发芽工艺。根据Box-Behnken的中心组合设计原理[10]，通过Design Expert 8.0软件对实验数据进行分析，预测糙米发芽的最佳工艺条件。各因素及水平编码如表1所示。

表1 Box-Behnken实验因素及水平Table 1 Three main induction conditions and their levels for Box-Behnken design

1.2.6 最佳发芽条件的验证 根据优化实验结果，采用Design Expert软件求得回归方程，以发芽糙米GABA含量最大化为目标，计算得到培养发芽糙米工艺参数和理论含量，将得到的工艺参数修正以便于操作后，进行验证实验，评价工艺参数的可靠性。

1.2.7 数据处理 应用Design-Expert 8.0软件进行Box-Behnken中心组合实验设计，进行数据的回归和线性分析。数据经过分析后，通过软件会得到3D图和等高线图，用作进一步分析研究。根据统计确定系数R2判断多项式模型方程的质量。通过方差分析（ANOVA）来观察显著性，显著性水平设置为p＜0.05。

2 结果与分析

2.1 单次能量对发芽糙米GABA含量的影响

图1 单次能量对GABA含量的影响Fig.1 Effect of single energy on the GABA content

由图1可以看出，脉冲强光处理对GABA含量的提高有一定促进作用。在一定范围内，单次能量越高，GABA含量越高；在400J处理时，GABA含量达到最大值。脉冲强光处理后，不同单次能量处理分别比对照组提高了15.5%、31.0%、45.1%、64.0%、15.5%。一定闪照次数下，单次能量太高，会让对糙米内部升温很快，不利于酶活的提高；单次能量太低，酶活提高有限。本实验条件下，单次能量400J较为适宜。

2.2 闪照次数对发芽糙米GABA含量的影响

图2 闪照次数对GABA含量的影响Fig.2 Effect of flash number on the GABA content

由图2可以看出，闪照次数不同，发芽糙米GABA含量不同；随着闪照次数的升高，GABA含量呈现先上升后下降的趋势；其中，闪照次数为300次时，种子内部酶活被适当的能量所激发使得GABA含量最高。少于或多于能量综合都会降低GABA富集的含量。在单次能量固定的情况下，不同闪照次数的脉冲强光处理后，分别比对照组提高了9.4%、39.6%、64.0%、20.9%、2.8%。在实验过程中，处理次数≥400次时，糙米表皮颜色明显变深，影响糙米感官品质，其他处理糙米表皮无明显加深。本实验条件下，闪照次数为300次较为适宜。

2.3 物料厚度对发芽糙米GABA含量的影响

图3 物料厚度对GABA含量的影响Fig.3 Effect of material thickness on the GABA content

由图3可以看出，物料厚度不同，脉冲强光闪照处理对糙米GABA含量影响不同。随着物料厚度的增加，发芽糙米中GABA含量逐渐降低；料层厚度为4层时，脉冲强光闪照处理后，糙米中GABA含量仅提高了17.2%。本实验条件下，由于脉冲强光的穿透力较差，只对糙米表层组织有影响，因此单层糙米进行脉冲强光处理效果最佳。

2.4 闪照距离对发芽糙米GABA含量的影响

由图4可以看出，在其他处理条件相同，闪照距离不同的情况下，发芽糙米GABA含量有所不同，呈现先上升后下降的趋势；其中，闪照距离为11.3cm时，GABA含量最高。不同闪照距离的脉冲强光处理后，分别比对照组提高了43.5%、54.0%、64.0%、52.1%、 46.2%、33.9%。随着闪照距离的加大，GABA含量先较快升高（可能是由于距离近脉冲强光能量过大造成种子内部酶活性的降低，从而影响GABA富集含量的降低）达到最高值又缓慢下降（可能是脉冲强光随着闪照距离的增大，部分能量散失所导致）的趋势。本实验条件下，闪照距离为11.3cm较为适宜。

2.5 开始处理时间对发芽糙米GABA含量的影响

图4 闪照距离对GABA含量的影响Fig.4 Effect of flash distance on the GABA content

图5 开始处理时间对GABA含量的影响Fig.5 Effect of start processing time on the GABA content

由图5可以看出，不同时间进行脉冲强光处理，对糙米GABA含量影响不同。在浸泡前对糙米进行一定强度的脉冲强光照射处理，由于GAD的活性还没有被激活因此对糙米中GABA含量影响很小。浸泡后脉冲强光处理，糙米GABA含量提高了64.0%。而发芽12h后脉冲强光处理，可能是浸泡过程中种子中的GAD被分解并散失到浸泡液中造成流失，使糙米发芽时的GABA含量仅提高了26.4%，但是此时对糙米进行闪照处理，糙米表面颜色易变深，甚至造成胚芽的损伤。本实验条件下，脉冲强光开始处理时间选择在浸泡后较为适宜。

2.6 响应面分析法优化脉冲强光处理条件结果分析

2.6.1 实验因素水平编码与实验结果 应用Design-Expert 8.0软件进行Box-Behnken中心组合实验设计，分别在相应的脉冲强光处理条件下进行糙米浸泡发芽培养，以发芽糙米中GABA含量为响应值（Y），进行响应面实验，实验设计及结果如表2所示[11]。

2.6.2 回归模型的建立及统计分析 根据表2的实验结果，通过Design Expert 8.0软件处理确定回归方程，该实验的回归方程为：

Y=347.6-14.33A-17.55B-4.78C-40.6AB-5.75AC-12.75BC-53.2A2-33.1B2-28.15C2

表2 Box-Behnken实验设计及结果Table 2 Test design and results of Box-Behnken design

回归模型进行方差分析及可信度分析结果见表3。

根据α=0.05显著水平剔除不显著项，简化后的回归方程为：Y=347.6-14.33A-17.55B-40.6AB-12.75BC-53.2A2-33.1B2-28.15C2

根据表3可知，该回归模型显著（p=0.0002），除了方程的一次项C和交互项AC影响不显著，交互项BC影响显著外，其他均极显著，且该模型极显著（p＜0.01）。因变量与自变量之间的线性关系显著（R2= 0.9906），模型调整复相关系数R2adj=0.9735，说明该模型能解释97.35%响应值的变化，拟合程度较好[12]。失拟项不显著（p＞0.05），说明本实验所得二次回归方程能很好地对响应值进行预测[13]。

图6 各两因素交互作用对GABA含量影响的响应曲面Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of pairwise interactions among various process conditions on the GABA content

表3 回归方程的统计分析Table 3 Statistical analysis of regression equation

2.6.3 响应面因素水平的优化 回归方程各交互项的响应曲面见图6。

根据回归方程绘制响应面分析图，运用Design Expert 8.0软件对模型进行分析，寻求发芽糙米GABA含量最大值的稳定点及对应的因素水平[14]，由图6可知，回归模型存在稳定点，稳定点即极大值点，通过对 回 归 模 型 求 一 阶 偏 导[15]，得 到A、B、C的 编 码 值 为-0.044、-0.234、-0.028，利用编码公式Xi=（Xj-X0）/Δj将上述编码值转变为实际参数为：单次能量395.55J、闪照次数276.65次、闪照距离11.27cm，此时发芽糙米GABA含量为350.025mg/100g。

2.7 验证实验

将上述脉冲强光最佳参数修正为单次能量400J、闪照次数277次、闪照距离11.3cm，重复实验5次，得发芽糙米GABA含量实测值为345.7mg/100g，与理论值350.025mg/100g接近，可以用此模型预测并指导生产实际。

3 结论

采用Box-Behnken响应面法建立影响因素的二次回归模型，对数据进行分析，糙米在30℃浸泡12h后，利用脉冲强光闪照处理富集GABA的最佳处理条件为单次能量400J、闪照次数277次、闪照距离11.3cm。拟合实验误差小，可为实际预测和评价发芽糙米GABA含量提供理论依据。

[1] 李思，方坚，梁建芬. 浸泡液对 糙米 发芽的影响 研究[J]. 食品科学，2007（7）：138-141.

[2] 姚森. 高γ-氨基丁酸含量的发芽糙米 品种筛选及 应用[D].武汉：华中农业大学，2008.

[3]丁俊胄，刘贞，赵思明，等.糙米发芽过程中内源酶活力及主要成分的变化[J]. 食品科学，2011（11）：29-32.

[4]Arazi T，Baum G，Snedden W A，et al.Molecular and biochemicalanalysis ofcalmodulin interaetions with the calmodulin-binding domain of plant glutamate decarboxylase[J]. Plant Physiol，1995，108（2）：551-561.

[5] 张璇，鲜瑶. 脉冲强光杀菌技术及其在果蔬上的应用[J]. 农产品质量与安全，2011（3）：44-47.

[6]张晖，姚惠源，姜元荣.γ-氨基丁酸的功能性及其在稻米制品中的富集利用[J]. 粮食与饲料工业，2002（8）：41-43.

[7]管娜娜，张晖，王立，等.米糠中γ-氨基丁酸的富集及纯化工艺研究[J]. 食品工业科技，2011（6）：292-295.

[8]孟祥勇.糙米、大豆发芽富集γ-氨基丁酸及复合谷物饮料的研究[D].无锡：江南大学，2009.

[9]蒋静，马涛.营养液培养糙米发芽富集GABA工艺条件优化[J]. 食品工业科技，2013（5）：195-199.

[10]姚森，郑理，赵思明，等.发芽条件对发芽糙米中γ-氨基丁酸含量的影响[J].农业工程学报，2006（12）：211-215.

[11]张根生，丁琬莹，王月，等.响应面法优化双酶酶解酪蛋白工艺[J]. 食品科学，2013（21）：237-241.

[12]JOSHI S，YADAV S，DESAI AJ.Application of responsesurface methodology to evaluate the optimum medium components for the enhanced production of lichenysin by Bacillus licheniformis R2[J].Biochemical Engineering Journal，2008（2）：122-127.

[13]谈佳玉，王承明.响应面法优化酶法制备花生蛋白的工艺研究[J]. 中国粮油学报，2011（8）：100-104.

[14]吴竹青，陈景，黄群，等.响应面法优化雪莲果酒发酵工艺[J]. 食品科学，2010（23）：182-187.

[15]马燕，高蕾，王青，等.响应面法优化浸提法提取甜杏仁油工艺参数[J]. 食品工业科技，2010（4）：229-231.

Optimization of pulsed light on the accumulation of GABA conditions in the process of brown rice germination

WANG Bo，MA Tao，HUI Li-juan，LIU He，HE Yu-tang
（College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，Grain and Oil Science and Technology Institute of Bohai University，Jinzhou 121013，China）

The enrichment of GABA during brown rice germination process was promoted by using pulsed light method.Meanwhile，the optimal treatment conditions were optimized by using response surface methodology：single energy of 400J，flash number of 277 and flash distance of 11.3cm.Under the optimized conditions ，the GABA content in germinated brown rice could reach to be 345.7mg/100g.

brown rice；GABA；pulsed light；response surface methodology（RSM）

TS201.1

B

1002-0306（2014）22-0281-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.053

2014－02－28

王勃（1986-），男，硕士研究生，实验员，研究方向：农产品加工与贮藏。