响应面优化桂花果实总黄酮超声辅助提取工艺研究

陶阿丽，冯学花，曹殿洁，戴 一，尹 伟

（安徽新华学院药学院，安徽合肥 230088）

响应面优化桂花果实总黄酮超声辅助提取工艺研究

陶阿丽，冯学花，曹殿洁，戴 一，尹 伟

（安徽新华学院药学院，安徽合肥 230088）

目的：响应面法优化桂花果实中总黄酮的超声辅助提取工艺。方法：以乙醇体积分数、超声时间、液料比为自变量，总黄酮提取率作为因变量，通过对自变量各水平的多元线性回归及二项式拟合，用响应面法优选工艺。结果：确定最佳提取工艺为乙醇体积分数为66%、超声时间为26min、液料比为25mL/g，总黄酮提取率达6.99%。结论：响应面法优选桂花果实中总黄酮超声辅助提取工艺，方法简单，结果可靠。

桂花果实，总黄酮，提取工艺，超声辅助，响应面法

桂 花（Osmanthus fragrans Lours.）为 木 犀 科 木 犀属植物，为常绿乔木或灌木，原产于中国西南部。桂花果实是桂花的果实，俗称桂子、桂花籽，每年3月开始结果，4月中旬成熟，呈椭圆形或长卵形状，长1.0～1.5cm，直径0.7～0.9cm，表面为棕色或紫棕色，有隆起的不规则皱纹。《本草纲目》记载：桂花籽，味甘、辛，性温，可化痰、生津、暖胃、平肝[1]。近年来，关于桂花中化学成分的研究报道较多，集中于桂花挥发油和黄酮类物质的提取、分离及其在抗氧化、抑菌等方面的作用[2]。但是，对桂花果实中黄酮类物质的研究少见报道[3-4]。

响 应 面 法（Response Surface Methodology，RSM）可以快速有效地确定多因素系统的最佳条件。近年来，广泛应用于化学工业、食品、生物学、医学以及制药等领域，与传统的单变量优化实验相比，具有实验次数少、周期短、精度高等优点[5]。

本实验利用超声波可有效提高提取率的特点，以桂花果实总黄酮的提取率为指标，采用响应面分析法对超声辅助提取桂花果实总黄酮进行工艺优化，得到桂花果实中总黄酮成分最佳提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桂花果实 采自安徽合肥大蜀山，经安徽中医药大学刘金旗教授鉴定为金桂子，于2013年3月18日桂花果实皮为青绿色时开始采摘，5d采摘1次，至桂花果实皮为紫黑色共采摘6次，采摘后60℃烘干，过40目筛备用；芦丁对照品 中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，1198-101018；硝酸铝、亚硝酸钠、无水乙醇等 均为分析纯。

DZF-6020型真空干燥箱 上海三发科学仪器有限公司；KQ118型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；UV-4802S型紫外可见分光光度仪 尤尼柯仪器有限公司；FA2004型电子天平 上海良平仪器有限公司；FY130型粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制 精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品10mg，置100mL烧杯中，用体积分数70%乙醇溶解并转移至50mL容量瓶中定容，摇匀，即得0.20mg/mL芦丁标准溶液。精密量取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分别置于25mL容量瓶中，加入70%的乙醇至10mL，加入5%亚硝酸钠1.0mL，摇匀，放置6min；再加入10%硝酸铝溶液1.0mL，摇 匀 ，放 置6min；加 入 1.0mol/L NaOH 溶 液10mL，加水至刻度，摇匀，放置15min。以不加芦丁对照品溶液为空白，在510nm处测吸光度，以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.2 总黄酮的超声辅助提取 精确称取1.0g桂花果实粉末，置于圆底烧瓶中。室温条件下，用乙醇作为提取剂，选取乙醇体积分数、液料比、超声时间三个因素，在不同条件下进行超声提取。提取后抽滤，吸取适量提取液测定黄酮含量。按照1.2.1方法，测定吸光度，按照下式计算总黄酮提取率[6]。

其中，C为提取液中总黄酮浓度（mg/mL），V为提取液体积（mL），m为桂花果实粉末质量（g）。

1.2.3 单因素实验方法 选取乙醇体积分数、超声时间和液料比进行单因素实验，考虑三种因素对桂花果实总黄酮提取率的影响。

1.2.3.1 乙醇体积分数的选择 取适量桂花果实粉末，分别加40%、50%、60%、70%、80%乙醇，固定料液比为15∶1（mL/g）、超声提取为30min，考察不同乙醇体积分数对桂花果实总黄酮提取率的影响。

1.2.3.2 超声时间的选择 取适量桂花果实粉末，超声提取时间分别为15、30、45、60、75min，固定乙醇体积分数为70%、料液比为15∶1（mL/g），考察不同超声时间对桂花果实中总黄酮提取率的影响。

1.2.3.3 液料比的选择 取适量桂花果实粉末，分别加溶剂10、15、20、25、30倍量，固定乙醇体积分数为70%、超声时间为为30min，考察不同液料比对桂花果实中总黄酮提取率的影响。

1.2.4 Box-Benhnken实验设计 通过单因素实验确定的各影响因素的适当范围，采用响应面分析法，依据Box-Benhnken的中心组合实验原理，以乙醇体积分数、超声时间和液料比三个因素为自变量，以桂花果实总黄酮提取率为因变量，应用Design-Expert 8.0.5软件，进行三因素三水平实验。分析因素与水平见表1。

表1 实验因素及水平安排表Table 1 Level and code of independent variable used for response surface analysis

2 结果与分析

2.1 线性回归方程

根据各浓度芦丁标准溶液对应的吸光度，计算得到线性相关系数R2=0.992，回归方程为A=0.1105C-0.0298。

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度实验结果 准确吸取芦丁对照品溶液2.00mL于10mL容量瓶中，加一定量70%乙醇至5mL，加入5%NaNO20.3mL，摇匀，放置6min；再加入10% Al（NO3）3溶 液 0.3mL，摇 匀 ，放 置 6min；加 入 1.0mol/L NaOH溶液4mL，加水至刻度，摇匀，放置15min。以不加芦丁对照品溶液为空白，在510nm处测定吸光度，连续6次，RSD为1.32%，精密度良好。

2.2.2 稳定性实验结果 取桂花果实粉约1g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入70%乙醇15mL，超声提取30min，滤过得供试品。精密吸取1份供试品溶液2mL，按照1.2.1项下方法显色，分别于间隔0、10、20、30、40、50、60min，在510nm波长处测定吸光度，1h内吸光度值无明显变化，RSD为1.17%，供试品溶液显色后在1h内稳定。

2.2.3 重复性实验结果 按照2.2.2所述供试品溶液的制备方法，制备6份供试品溶液，分别按照1.2.1项下方法显色测定吸光度，RSD为1.47%，此方法重复性良好。

表2 加样回收率结果Table 2 Results of recovery test

2.2.4 回收率实验结果 按照2.2.2所述供试品溶液的制备方法，制备6份供试品溶液，精密加入一定量对照品，用体积分数70%乙醇溶解并转移至50mL容量瓶中定容，摇匀。按照1.2.1项下方法显色，测定吸光度，结果见表2。结果表明，平均回收率为98.95%，RSD为0.65%，具有良好的回收率。

2.3 单因素实验

2.3.1 乙醇体积分数对提取效果的影响 不同乙醇体积分数对桂花果实总黄酮提取率的影响结果见图1。

图1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids

由图1可知，乙醇体积分数在40%～70%范围内，总黄酮提取率随乙醇体积分数的增大而增加。当乙醇体积分数大于70%以后，总黄酮提取率随着乙醇体积分数增大而下降，这是由于黄酮类是一类极性范围较广的化合物，在70%的乙醇溶液中，黄酮类物质能够最大限度地溶出。而当乙醇体积分数增大时，水溶性黄酮溶出量开始减少，而出现黄酮的提取率下降[7]。

2.3.2 超声时间对提取效果的影响 不同超声时间对桂花果实中总黄酮提取率的影响结果见图2。

图2 超声时间对总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on the yield of total flavonoids

由图2可知，随着超声时间的增加，黄酮提取率先增加后降低，30min时提取率最高，为6.85%。其原因可能是因为长时间超声波空化作用破坏了黄酮类化合物的结构，导致黄酮溶出减少[8]。

2.3.3 液料比对提取效果的影响 不同液料比对桂花果实中总黄酮提取率的影响结果见图3。

由图3可知，随着液料比的增加，总黄酮提取率增加。但是当液料比达到20∶1（mL/g）之后，当增加液料比时，总黄酮提取率的增加趋于缓慢，总黄酮的溶出基本达到最大。再继续增加溶剂的用量，不仅不能增加总黄酮提取率，反而会增加成本[9]。因此，液料比选择20∶1（mL/g）。

图3 液料比对总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the yield of total flavonoids

2.4 响应面法实验设计结果

根据单因素实验结果，选择提取条件为乙醇体积分数（A）、超声时间（B）、液料比（C）设计响应面分析实验，以桂花果实总黄酮提取率为响应值，实验设计及结果见表3、表4。

表3 响应面实验安排及结果Table 3 The response surface experimental design and results

采用Design-expert 8.0.5软件对表3结果进行响应面回归分析，得拟合方程：

Y=6.84-0.081A+0.37B+0.15C+0.64AB-0.32AC-0.55BC-0.67A2-0.92B2-0.028C2。作回归方程显著性检验及方差分析，结果见表4。

由表4可知，回归模型高度显著（p＜0.0001），失拟项 不 显 著（p=0.2062＞0.05）以 及 R2=0.9858，Adeq Precision=23.961（远大于4），可知回归方程拟合度和可信度均很高，能够很好地对桂花果实总黄酮的提取率进行预测。由回归模型系数显著性检验结果可知，模型的一次项B（p=0.0002＜0.01）、一次项C（p=0.0254＜0.05）对黄酮提取的线性效应显著，一次项A（p=0.1598＞0.05）对提取率没有显著影响；二次项A2（p＜0.0001）、B2（p＜0.0001）对黄酮提取的曲面效应极显著，而C2（p=0.7010＞0.05）不显著；交互项AB（p＜0.0001）、AC（p=0.0035＜0.01）、BC（p=0.0001＜0.01）都显著；表明各影响因素对黄酮提取率的影响不是简单的线性关系。

表4 响应面分析法对果胶提取率的ANOVA分析结果Table 4 The response surface analysis of pectin extraction rate of ANOVA analysis results

图4 乙醇体积分数和超声时间对提取率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration and ultrasonic time on the yield of total flavonoids

图5 乙醇体积分数和液料比对提取率的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration and liquid-solid ratio on the yield of total flavonoids

图6 超声时间和液料比对提取率的影响Fig.6 Effect of ultrasonic time and liquid-solid ratio on the yield of total flavonoids

通过响应面图（图4~图6），能够很直观的观察各因素以及各因素之间的关系。由图4可以看出当乙醇体积分数约为66%、超声时间约为27min时总黄酮提取率达到最大值，之后在最大值波动。由图5可以看出当乙醇体积分数约为66%、液料比约为25mL/g时总黄酮提取率达到最大值，之后在最大值波动。由图6可以看出当超声时间约为27min、液料比约为25mL/g时总黄酮提取率达到最大值，之后在最大值波动。

优化拟合方程，可得到模型的最大值，即乙醇体积分数为65.94%、超声时间为26.48min、液料比为25mL/g时提取率达到最大值为7.061%。考虑到实际操作性，对响应面二次回归所得最佳条件进行修正，确定最佳提取工艺为：乙醇体积分数为66%、超声时间为26min、液料比为25mL/g。

2.5 验证实验结果

为了验证响应面法的可行性，根据上述修正后条件，同条件下重复3次实验，得总黄酮提取率为6.99%。将所得实测值与二项式拟合方程预测的最大值进行比较，计算偏差，结果平均偏差为1.51%，偏差较小，说明该模型有效。

3 结论

通过采用中心组合设计实验和响应面分析，得到桂花果实总黄酮提取工艺的二次多项回归模型，模型拟合程度良好。优化得到的桂花果实总黄酮提取最佳工艺为：乙醇体积分数为66%、超声时间为26min、液料比25mL/g，响应值（提取率）为6.99%。黄酮成分是桂花及桂花果实中所含的一类重要的成分，具有抗衰老、抗癌等多种药理作用。研究桂花果实总黄酮的最佳提取工艺，对于其黄酮成分的深入研究提供一定的基础，对于桂花保健食品的深度开发具有重要的价值[10-11]。

[1] 刘龙昌，向其柏. 木犀属植物的研究进展[J]. 南京林业大学学报：自然科学版，2003，27（2）：84-89.

[2]王丽梅，余龙江，崔永明，等.桂花黄酮的提取纯化及抑菌活性研究[J]. 天然产物研究与开发，2008，20：717-720.

[3] 尹伟，刘金旗，张国升. 桂 花果实的化 学成分研究[J]. 中国中药杂志，2013，38（24）：4329-4334.

[4] 唐巧玉，周毅峰，朱 玉 昌. 桂 花 子黄酮 的 提 取工艺 优 化[J].食品科学，2009，30（18）：139-141.

[5]陈湘宁，李宇华，丁轲，等.响应面法优化超声波辅助提取柿子多糖的工艺研究[J].中国食品学报，2012，12（7）：105-111.

[6]冯学花，张国升，陶阿丽，等.微波辅助提取蚕豆种皮中总黄酮的条件优化[J]. 食品工业科技，2013，34（24）：244-247.

[7]王桃云，邱业先，郭伟强，等.响应面法优化藜根总黄酮提取工艺的研究[J]. 化学研究与应用，2012，24（6）：884-889.

[8]王汉卿，王文苹，闫津金，等.超声提取枸杞叶中总黄酮提取工艺及其不同采收期含量变化研究[J]. 中国实验方剂学杂志，2011，17（8）：44-47.

[9] 陈健，孙爱东，高雪娟，等.响应面分析法优化超声波提取槟榔原花青素工艺[J]. 食品科学，2011，32（4）：82-86.

[10] 王学利，曹华茹，谢绍军.桂华叶总黄酮提取方法的研究[J]. 浙江林业科技，2008，28（5）：50-53.

[11]陶阿丽，戴一，华芳，等.桂花中总黄酮提取工艺及采收期研究[J]. 食品与发酵工业，2013，39（2）：247-249.

Optimizing ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids from fruits of Osmanthus fragrans Lour.

TAO A-li，FENG Xue-hua，CAO Dian-jie，DAI Yi，YIN Wei
（College of Pharmaceutical Sciences of Anhui Xinhua University，Hefei 230088，China）

Objective ： To optimize ultrasonic-assisted extraction techniques of total flavonoids from fruits of Osmanthus fragrans Lour.by using response surface method.Methods：Ethanol concentration，ultrasonic time and liquid-solid ratio served as independent variables while the total flavonoids served as the dependent variable.Based on multiple linear regression and binomial expression，central composite design and response surface method were employed to optimize the extracting process.Results ：The optimized extraction conditions were ethanol concentration （66% ） ，ultrasonic time （26min ） and liquid-solid ratio （25mL/g ） ，and affected the total amount of extraction（6.99% ）.Conclusion：The optimum process，simple in methodology，yet yields reliable results.

fruitsofOsmanthus fragrans Lour.；totalflavonoids；extractiontechnology；ultrosonic-assisted；response surface method

TS214.9

B

1002-0306（2014）22-0264-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.049

2014－04－22

陶阿丽（1983-），女，硕士研究生，讲师，研究方向：基础化学与天然产物开发。

安徽新华学院校级精品课程（2012jpkcx07）。