大米黑曲霉的微波杀菌工艺优化

徐艳阳，李科静，仇 洋，郑 丽

（吉林大学生物与农业工程学院，吉林长春 130022）

大米黑曲霉的微波杀菌工艺优化

徐艳阳，李科静，仇 洋，郑 丽

（吉林大学生物与农业工程学院，吉林长春 130022）

为了探讨微波处理对大米霉菌的杀灭效果，以黑曲霉为研究对象，应用响应面法对大米中黑曲霉的微波杀菌工艺进行优化研究，考查微波功率、微波时间和菌悬液体积对大米黑曲霉孢子减少对数周期的影响，并建立相应的模型。结果表明最佳工艺条件为：微波功率231W、微波时间4min、菌悬液体积97mL，在此条件下黑曲霉孢子减少对数周期为4.8920±0.0882，实际值与理论值的相对误差为4.37%。与水浴加热法相比，微波法的杀菌效果是其杀菌效果的8.5倍。

大米，黑曲霉，微波，杀菌，响应面法

稻谷是我国主要的粮食作物之一，年产量约1.85亿t[1]，折合大米1.26亿吨，约占粮食总产量的40%。我国每年因大米霉变造成的损失约100万吨[2]，引起大米霉变的菌属主要有青霉属、曲霉属、根霉属和镰刀霉属，其中青霉属和曲霉属是优势菌属，产生毒素的主要是曲霉属和镰刀霉属[3-5]。黑曲霉是曲霉属中一个常见菌种，在粮食中广泛存在[6]。在高温、高湿环境下储藏，粮食中的霉菌就极容易大量生长繁殖产酶生热，且在代谢过程中还会产生毒素，严重危害人体的健康[7-8]。

微波是指频率为300MHz~300GHz之间的电磁波，利用微波杀菌是近年来新兴的杀菌方法之一，因其在杀菌过程中具有快速、高效、安全、环保等特点[9-10]，被广泛应用于医药和食品工业[11-13]。目前，国外学者Lee KY等[14]研究了微波诱导的氩等离子体对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌作用；Hamoud-Agha M M等[15]研究了大肠杆菌的微波失活；Fang Y P等[16]研究了低剂量的微波辐射对大米中寄生曲霉的杀菌作用 ；张 习 军 等[17]研 究 了 微 波 处 理 对 大 米 的 加 工 、食用、储藏等品质的影响；胡坚[5]对微波杀灭大米中寄生曲霉的机理进行了探究，但对大米中黑曲霉的微波杀菌作用方面的研究尚未见报道。因此，本文针对大米中黑曲霉进行微波杀菌工艺研究，拟将微波杀菌应用到大米防霉过程中，避免传统的化学方法如药剂熏蒸带来的药物残留和污染问题，以及物理方法如低温气调储藏成本高等缺点，为粮食储藏高质量、高营养、高效益、低损耗、低污染的目标提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑曲霉 吉林大学食品微生物实验室从大米中分离、鉴定得到；磷酸氢二钾、硫酸亚铁、苯酚、氯化钠、无水乙醇、氯化钾 北京化工厂；琼脂 海南省琼海长坡琼青琼脂厂；蔗糖、硝酸钠 西陇化工股份有限公司；硫酸镁 天津市光复精细化工研究所；甘油、吐温-80 天津市华东试剂厂；所用试剂 均为分析纯。

MM721AAU-PW美的微波炉 美的微波电器制造有限公司；JA3003A电子精密天平 上海精天电子仪器有限公司；LD4-2A低速离心机 北京雷勃尔离心机有限公司；DSX-280A不锈钢手提式高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；DHP060恒温培养箱 上海实验仪器厂有限公司；DMXY数码生物显微镜 浙江宁波舜宁仪器有限公司；SW-CJ-1DF洁净工作台 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；QL-901试管振荡器 金坛市医疗仪器厂；SHA-C水浴恒温振荡器 江苏金坛市恒丰仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 黑曲霉孢子菌悬液的制备 将斜面保藏的黑曲霉转接至平板中，28℃进行纯培养3~5d后，用一定量的洗脱液（体积分数0.05%吐温-80、pH为7.0~ 7.2的磷酸盐缓冲液）将孢子洗至装有玻璃珠的锥形瓶中，摇匀、用纱布过滤除去菌丝体，4000r/min离心15min后，用0.85%生理盐水将菌悬液浓度调至106CFU/mL备用。

1.2.2 实验指标 黑曲霉微波杀菌效果采用孢子减少对数周期（Y）表示：

式中，N为经微波处理后的菌落数（CFU/mL），N0为初始的菌落数（CFU/mL），黑曲霉菌落计数按照GB4789.15-2010。

1.3 单因素实验设计

1.3.1 微波功率对大米黑曲霉孢子减少对数周期的影响 量取5份100mL黑曲霉孢子菌悬液，在119、231、385、539、700W条件下微波4min后，测其菌落数，计算孢子减少对数周期。

1.3.2 微波时间对大米黑曲霉孢子减少对数周期的影响 量取5份100mL黑曲霉孢子菌悬液，在119W功率下，分别处理2、4、6、8、10min后，测其菌落数，计算孢子减少对数周期。

1.3.3 菌悬液体积对大米黑曲霉孢子减少对数周期的影响 在119W功率下，菌悬液体积分别为50、100、150、200、250mL微波4min后，测其菌落数，计算孢子减少对数周期。

1.3.4 响应面实验优化设计 在单因素实验结果的基础上，以微波功率、微波时间、菌悬液体积作为考察因素，黑曲霉孢子减少对数周期为指标，采用Box-Benhnken中心组合实验设计进行优化研究，各因素水平设计及编码见表1。

1.4 水浴加热法杀菌对比实验设计

1.4.1 微波杀菌法 量取3份97mL菌悬液，在微波时间4min、微波功率231W条件下进行处理后，测其菌落数，计算3次处理黑曲霉孢子减少对数周期的平均值。

1.4.2 水浴加热法 将水浴温度升至87℃，取3个装有97mL菌悬液的锥形瓶，水浴加热4min后，计算3次处理的平均值。

1.5 数据处理与分析

每次实验重复三次，采用Excel2007软件计算平均 值 、标 准 偏 差 及 绘 图 ，采 用 SPSS17.0和 Design-Expert 8.05软件进行数据分析。

表1 实验因素水平编码表Table 1 Coded variables and levels of facters

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 微波功率对大米黑曲霉孢子减少对数周期的影响 在菌悬液体积、微波时间相同的条件下，考察不同的微波功率对黑曲霉孢子减少对数周期的影响，结果见图1。

图1 微波功率对大米黑曲霉孢子减少对数周期的影响Fig.1 Effects of microwave power on log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger from rice

由图1可知，微波功率与黑曲霉孢子减少对数周期呈正相关趋势，通过方差分析，微波功率对黑曲霉孢子减少对数周期的影响显著（p＜0.05）。经LSD多重差异比较分析，385、539、700W之间差异不显著（p＞0.05），当微波功率为385W时，菌悬液在杀菌过程中开始出现沸腾和冲出现象。因此从实验的准确性和可实施性角度考虑，微波功率选231W较佳。

2.1.2 微波时间对大米黑曲霉孢子减少对数周期的影响 在菌悬液体积、微波功率相同的条件下，考察不同的微波时间对黑曲霉孢子减少对数周期的影响，结果见图2。

由图2可知，随着微波时间的增长，黑曲霉孢子减少对数周期逐渐增大，通过方差分析，微波时间对黑曲霉孢子减少对数周期的影响显著（p＜0.05）。当微波时间为6min时，菌悬液开始出现沸腾现象并有液体冲出，菌悬液体积减少约10mL。因此，从实验的准确性考虑，选4min为较佳微波时间。

2.1.3 菌悬液体积对大米黑曲霉孢子减少对数周期的影响 在微波时间、功率相同的条件下，考察不同的菌悬液体积对大米黑曲霉孢子减少对数周期的影响，结果见图3。

由图3可知，菌悬液体积与黑曲霉孢子减少对数周期呈负相关趋势，通过方差分析，菌悬液体积对黑曲霉孢子减少对数周期的影响显著（p＜0.05）。经LSD多重差异比较分析，50与100mL、200与250mL之间差异不显著（p＞0.05）；100、150、200mL之间差异显著（p＜0.05），当菌悬液体积为50mL时，菌悬液在杀菌过程中出现沸腾和液体冲出现象。因此，选100mL为较佳菌悬液体积。

图2 微波时间对大米黑曲霉孢子减少对数周期的影响Fig.2 Effects of microwave time on log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger from rice

图3 菌悬液体积对大米黑曲霉孢子减少对数周期的影响Fig.3 Effects of mould suspension volume on log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger from rice

2.2 响应面法优化与分析

2.2.1 回归方程的建立及显著性检验 在单因素实验的基础上，用Design-Expert 8.05软件对各因素及水平进行设计，实验结果见表2和表3。

应用Design-Expert 8.05软件对实验数据进行多元回归拟合，得到黑曲霉孢子减少对数周期（Y）与微波功率（A）、微波时间（B）、菌悬液体积（C）的二次回归方程为：

Y=+5.10+0.40A-0.28B+0.43C-1.45AB+1.83AC+ 2.27BC-1.98A2-1.42B2-1.10C2

由表3可知，决定系数R2=0.9953，说明该模型拟合程度较好，p＜0.0001表明该模型有非常高的显著性，失拟项p=0.1602＞0.05不显著，表明该模型不失拟，可以用于大米黑曲霉微波杀菌工艺优化的研究；从回归方程中一次项的方差分析中可知，微波功率、微波时间和菌悬液体积对黑曲霉孢子减少对数周期的影响为极显著；从交互项方差分析中得出微波时间和菌悬液体积的交互作用、微波功率和微波时间、微波功率和菌悬液体积交互作用极显著。

表2 实验结果Table 2 Results of experiments

表3 二次回归方程的方差分析Table 3 ANOVA for quadratic regression equation

2.2.2 响应面分析 根据回归方程来绘制交互作用较为明显的响应面立体分析图，结果见图4~图6。

由图4可知，随着微波功率的增加，黑曲霉孢子减少对数周期先增后减；随着微波时间的延长，黑曲霉孢子减少对数周期先增后减，且因微波功率曲面较陡，所以微波功率对黑曲霉孢子减少对数周期的影响较微波时间显著。等高线的形状反映出两因素交互作用的强弱，椭圆形表示交互作用显著，圆形表示交互作用不显著，由图4中等高线图可以看出，微波时间和微波功率的交互作用显著。

图4 微波功率与微波时间对大米黑曲霉孢子减少对数周期影响的响应面图Fig.4 Response surface plots of effects of microwave power and microwave time on log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger from rice

图5 微波功率与菌悬液体积对大米黑曲霉孢子减少对数周期影响的响应面图Fig.5 Response surface plots of effects of microwave power and mould suspension volume on log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger from rice

图6 微波时间与菌悬液体积对大米黑曲霉孢子减少对数周期影响的响应面图Fig.6 Response surface plots of effects of microwave time and mould suspension volume on log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger from rice

由图5可知，随着微波功率的增加，黑曲霉孢子减少对数周期先增后减；随着菌悬液体积的增多，黑曲霉孢子减少对数先增后减，且菌悬液体积曲面较陡，菌悬液体积较微波功率影响显著。等高线图呈椭圆形，所以菌悬液体积和微波功率的交互作用显著。

从图6看出，随着菌悬液体积的增多，黑曲霉孢子减少对数周期逐渐减小，随着微波时间的延长，黑曲霉孢子减少对数周期呈逐渐增大的趋势，因菌悬液体积曲面较陡，菌悬液体积较微波时间影响显著。由图6中等高线图呈椭圆形可知，菌悬液体积和微波时间的交互作用显著。

通过响应面分析可知，影响微波杀菌的因素大小顺序为：菌悬液体积＞微波功率＞微波时间。当微波功率264W、微波时间3.39min、菌悬液体积96.94mL时，黑曲霉孢子减少对数周期达到理论最大值5.1153。

2.3 验证实验

实际设备的功率最大可达231W，所以考虑到实际操作性，对理论值进行修正：微波功率231W、微波时间4min、菌悬液体积97mL此时大米黑曲霉孢子减少对数周期为4.8920±0.0882，与理论值相差4.37%，表明用响应面法优化得到大米中黑曲霉微波杀菌的工艺条件是可靠的。

2.4 对比实验

微波杀菌法和水浴加热法对比实验结果值见表4。

表4 微波杀菌法和水浴加热法对比实验（n=3）Table 4 Comparative experiment of microwave treatment andwater-bath heating treatment（n=3）

水浴加热处理后的黑曲霉孢子减少对数周期为0.5764±0.0043；微波法处理后的黑曲霉孢子减少对数周期为4.8920±0.0882。因此，微波法的杀菌效果是水浴加热法的8.5倍。

3 结论

采用三因素三水平响应面法对大米中黑曲霉微波杀菌工艺进行优化研究，获得微波杀菌的最佳条件为：微波功率231W、微波时间4min、菌悬液体积97mL。通过三次验证实验，测得黑曲霉孢子减少对数周期为4.8920±0.0882，实际测定值与理论预测值的相对误差为+4.37%。与水浴加热法相比，微波法的杀菌效果是其8.5倍。

[1] 万鹏. 大米品质检测系统研究[D].长春：吉林大学，2009.

[2] 陈伟畅. 大米天然防霉保鲜剂的研究[D]. 无锡：江南大学，2008.

[3] 谢刚.粮食污染主要真菌毒素的研究[D]. 成都：四川大学，2005.

[4] 吴磊，高群玉，石英. 大 米储藏保鲜 技术研究新进展[J]. 粮油食品科技，2008，16（6）：4-7.

[5]胡坚.寄生曲霉的微波效应研究[D]. 武汉：华中农业大学，2009.

[6] 齐祖同. 中国真菌志-曲霉属及其相关有性型[M]. 北京：科学出版社，1997：99-101.

[7] 张东杰，王颖，翟爱华. 大米质量安全关键控制技术[M]. 北京：科学出版社，2011：62-63.

[8]Tanaka K J，Sago Y K，Zheng Y Z，et al.Mycotoxins in rice [J].International Journal of Food Microbiology，2007，119（1-2）：59-66.

[9]Terigar B G，Balasubramanian S，Boldor D，et al.Continuous microwave-assisted isoflavone extraction system：Design and performance evaluation[J].Bioresource Technology，2010 ，101（7）：2466-2471.

[10]Ribeiro D G，Pavarina A C，Dovigo L N，et al.Denture disinfection by microwave irradiation：A randomized clinical study [J].Journal of dentistry，2009，37（9）：666-672.

[11]Dorantes-Alvarez L，Jaramillo-Flores E，González K，et al. Blanching peppers using microwaves[J].Procedia Food Science，2011，1：178-183.

[12]Cendres A，Chemat F，Maingonnat J F，et al.An innovative process for extraction of fruit juice using microwave heating[J]. LWT-food science and technology，2011，44（4）：1035-1041.

[13]Matsuia K N，Granadob L M，DE Oliveira P V，et al. Peroxidase and polyphenol oxidase thermal inactivation by microwavesin green coconut water simulated solutions[J].LWT-food science and technology，2007，40（5）：852-859.

[14]Lee K Y，Park B J，Lee D H，et al.Sterilization of Escherichia coli and MRSA using microwave-induced argon plasma at atmospheric pressure[J].Surface and Coatings Technology，2005，193（1-3）：35-38.

[15]Hamoud-Agha M M，Curet S，Simonin H，et al.Microwave inactivation of Escherichia coli K12CIP 54.117 in a gel medium：Experimental and numerical study[J].Journal of Food Engineering，2013，116（2）：315-323.

[16]Fang Y P，Hu J，Xiong S B，et al.Effect of low-dose microwave radiation on Aspergillus parasiticus[J].Food Control，2011，22（7）：1078-1084.

[17] 张习军，熊善柏，赵思明. 微波处理对稻谷品质的影响[J].中国农业科学，2009，42（1）：224-229.

Process optimization of microwave sterilization for Aspergillus niger from rice

XU Yan-yang，LI Ke-jing，QIU Yang，ZHENG Li
（College of Biological and Agricultural Engineering，Jilin University，Changchun 130022，China）

In order to explore the killing effects of microwave treatment on molds from rice ，response surface methodology was used to optimize process of microwave sterilization Aspergillus niger from rice.Effect of microwave power， microwave time ，and mould suspension volume on log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger from rice were investigated，and corresponding regression equation was established.Results showed that optimum sterilization conditions were as follows：microwave power of 231W，microwave time of 4min，and mould suspension volume of 97mL.Under these conditions，log-periodic reduction of spores of Aspergillus niger was 4.8920±0.0882 ，relative error between determined and predicted value of log-periodic reduction of spores was 4.37%.Compared with water-bath heating treatment，effect of microwave sterilization was 8.5 times as much.

rice；Aspergillus niger；microwave；sterilization；response surface methodology

TS210

B

1002-0306（2014）22-0245-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.045

2014－02－13

徐艳阳（1972-），女，博士，副教授，主要从事食品营养与安全方面的研究。

吉林省科技发展计划项目（20120717）；吉林大学本科教学改革研究项目（2013138）；吉林大学基本科研业务费项目（450060487501）。