四种北高丛蓝莓提取物抗氧化作用的研究

朱 颖，孙晓红，*，姜文洁，赵 勇，吴启华，潘迎捷

（1.上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（上海），上海 201306；2.美国缅因大学食品与农业学院，美国缅因州 04469）

四种北高丛蓝莓提取物抗氧化作用的研究

朱 颖1，孙晓红1，*，姜文洁1，赵 勇1，吴启华2，潘迎捷1

（1.上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（上海），上海 201306；2.美国缅因大学食品与农业学院，美国缅因州 04469）

以四个北高丛蓝莓品种的甲醇提取物为研究对象，分别用紫外分光光度计测定总糖、总酚、花青素及黄酮的含量，并利用体外法研究了四种蓝莓提取物对DPPH自由基的清除作用。结果表明，同一时期同一地点采摘的蓝莓，总糖、总酚、花青素以及黄酮含量最高的是爱国者，它们的值分别为9.77%，1.91mg/g，0.668mg/g，0.22mg/g，其次为北青，含量最低的为尼尔森（除花青素外）。四个品种的蓝莓甲醇提取物对DPPH自由基均具有不同程度的清除作用，爱国者和北青的DPPH自由基清除能力较强，能够达到30%以上，这与其中所含的总酚、花青素的含量呈正相关。

蓝莓，总糖，总酚，花青素，黄酮，抗氧化

蓝 莓（Ericaceae Vacinium spp.）又 名 蓝 浆 果 、越桔等，属杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinmum.L）植物，为多年生落叶或常绿灌木或小灌木[1]。我国现在主要的栽培品种有高丛蓝莓、矮丛蓝莓和兔眼蓝莓，主要分布在东北地区、山东、内蒙古等地。据科学研究发现，蓝莓果实具有防止脑神经衰老、增强心脏功能、明目抗癌等独特功效。因此，蓝莓被联合国粮农组织（FAO）确定为人类五大健康食品之一[2]，也被称为继苹果和柑桔之后的“世界第三代水果”。据美国农业部人类营养研究中心称，蓝莓是所研究过的40多种果蔬中抗氧化成分最丰富的一种[3]。它除了含有熟知的维生素C、维生素E、番茄红素、类胡萝卜素等有抗氧化营养素以外，还含有丰富的多酚类等物质，包括花青素、黄酮等，因此具有更高的抗氧化性[4]。

由各种氧自由基引发的氧化作用，是导致身体各组分和器官损伤、病变的重要原因之一。而人体内的各种内源性抗氧化物（比如VC、VE、辅酶Q、SOD等）是防御自由基氧化胁迫的第一道防线，当它们防御能力减弱的时，就需要从食品中去补充外源性抗氧化物（比如多酚、类黄酮、花色素苷等）来有效地阻断和消除各种氧化损伤，使得机体保持健康状态，延缓衰老。蓝莓具备的高抗氧化能力已经被大家熟知，这是由于它富含花青素以及其他多酚类物质。

近年来，国内外学者对蓝莓的活性成分以及功能进行了研究。国外Xianli Wu[5]用蓝莓和木莓的提取液进行了人体的实验，实验结果表明：花青素对于尿道感染发炎作用有很好的保护和预防作用。Fitzpatrick[6]的研究表明原花青素具有血管舒张效应，可以预防一些慢性疾病。Alison Lacombe[7]用蔓越莓的粉末进行了成分的提取，从中分离出了花青素、酚类物质、有机酸等，用这些活性成分做了抑菌研究。Wilms[8]实验证明女性志愿者服用富含槲皮素的蓝莓苹果汁可以保护人类淋巴细胞的DNA不被过氧化氢破坏，而用以说明其具有抗癌与抗氧化作用。Matchett[9]发现矮丛蓝莓所含的黄酮类物质可以抑制前列腺癌细胞基质金属蛋白酶，证明黄酮类物质具有很好的抗癌作用。国内刘文旭等[10]测定了草莓、蓝莓、黑莓中多酚类物质的抗氧化活性，结果表明总酚含量与抗氧化能力之间显著性相关。刘翼翔[11]以野生蓝莓为研究材料，分析了其中总酚、花色苷及维生素C等功能成分的含量，研究了其抑制细胞氧化损伤的功能，结果表明多酚类物质有良好的抗氧化活性，而除花色苷外，酚酸也是蓝莓中的主要抗氧化活性物质。王静[12]用大孔树脂对蓝莓中的花青素进行纯化，并通过小鼠受热致痛法等来研究蓝莓花青素的镇痛和抗炎作用效果。实验证实纯化后的花青素可提高小鼠痛阈、抑制耳廓肿胀，具有明显的镇痛和抗炎作用。陈健[13]用 甲 醇 提 取 蓝 莓 中 的 花 青 素 并 进 行 纯 化 ，用DPPH法测定其抗氧化能力，结果显示，花青素有较好的清除DPPH自由基的能力。刘小莉[14]用微波萃取蓝莓叶中的总黄酮，并用DPPH法测定提取物清除自由基的能力，与阳性对照二丁基羟基甲苯和抗坏血酸进行比较，结果显示蓝莓叶提取物具有良好的抗氧化活性。

以前蓝莓种植户只是改善果实的大小、果实的产量、果实的颜色以及果实的味道，而现在更关注的是蓝莓的营养价值，选择营养价值高抗氧化能力强的品种去进行培育。本实验选用化学分析法测定了同一地区的四个北高丛蓝莓品种甲醇提取物的总糖、总酚、花青素和黄酮的含量，并对其清除DPPH自由基的能力做了研究，通过比较同一地区不同品种的成分含量及抗氧化能力的大小，为蓝莓品种的栽培及果实的综合开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

样品 蓝丰（Bluecrop）、北青（Northblue）、爱国者（Patriot）、尼尔森（Nelson）四种北高丛蓝莓果实购自青岛沃林农业有限公司，-20℃冷冻储藏备用；没食子酸标准品、芦丁标准品、福林酚、乙醇、甲醇、甲酸、浓硫酸、氯化钾、醋酸钠、苯酚、硝酸铝、碳酸钠、氢氧化钠、亚硝酸钠 国药集团化学试剂有限公司：DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼） Sigma公司：所有试剂 均为分析纯。

8010s组织匀浆机Waring Commerial；pl2002电子天平MettlerToledo；SK5200HP超声波清洗机 上海科导超声波仪器有限公司；GG17旋转蒸发仪

SENCO；TDZ5-WS离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；SHB-3循环水真空泵 上海申生科技有限公司；TU-1810紫外可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蓝莓甲醇提取物的制备[5]将四种蓝莓冻果取出，解冻，组织匀浆机匀浆，称取20g匀浆用20mL含0.5%甲酸的85%甲醇溶液进行提取，再进行超声波处理10min，然后静置10min，静置完毕后4550g离心10min，取上清液至烧杯。沉淀继续按上述步骤进行提取，使得成分充分浸提。每次的上清液混合进行45℃旋转蒸发45min至甲醇甲酸挥发完全蒸干，加入10mL蒸馏水，浓缩至2g/mL，置于4℃冰箱保存备用。

1.2.2 蓝莓提取物总糖含量的测定方法 总糖含量的测定采用GB/T 5009.7-2008方法并加以改进，以蔗糖溶液为标准物。取6支25mL刻度试管（重复做两组），加入100μg/L蔗糖标准液，用蒸馏水补足至2mL。按顺序向试管内加入1.0mL 0.09g/mL苯酚溶液摇匀，再从管液正面在5~20s内加入5mL浓硫酸，摇匀。混合液总体积为8mL，在室温下放置30min中进行反应。然后以空白为参照，在485nm处进行比色测定吸光度值。以蔗糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，求出线性回归方程，由回归方程得到提取物中总糖含量。总糖测定标准曲线见图1。

图1 蓝莓总糖测定的标准曲线Fig.1 Standard curve of blueberry total sugar

样品的测定：准确吸取适当稀释倍数的测试样品0.5mL于试管中，再按上述步骤操作，测定样品的吸光度，以标准曲线计算总糖含量。

结果计算：根据显色液吸光度值，在标曲上查出相应的蔗糖质量，按下式计算总糖含量，以质量分数（%）表示。

式中：m′：从标准曲线中查得的蔗糖质量，μg；V：样品提取液总体积，mL；N：样品提取液稀释倍数；V2：测定时所取样品提取液体积，mL；m：样品质量，g。

1.2.3 蓝莓提取物总酚含量的测定 根据García[15]方法进行改进，以没食子酸为标准物。准确称取没食子酸标准品0.050g，用超纯水配制成0.1mg/mL的没食子酸标准溶液。准确移取没食子酸标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于5mL容量瓶中，分别用超纯水补足至1.0mL，再加入0.4mL福林酚（FC）试剂，0.8mL质量分数10%的Na2CO3饱和溶液，充分混匀后用水定容至5mL，室温下静置2h，随后于770nm波长处测定吸光度。以没食子酸的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线见图2。

准确吸取一定浓度的待测样品提取液100μL，水补足至1.0mL。测定步骤与绘制标准曲线相同，按顺序加入福林酚试剂、Na2CO3饱和溶液，显色并测定吸光度值。待测液中总酚含量以每克样品相当于没食子酸的毫克数表示。

图2 蓝莓总酚测定的标准曲线Fig.2 Standard curve of gallic acid

1.2.4 蓝莓提取物花青素含量的测定 花青素的含量 用pH示 差 法 进 行 测 定[16]。 取 蓝 莓 粗 提 液1mL，加入 pH4.5 的 0.4mol/L 的 醋 酸 钠 缓 冲 液 或 pH1.0 的0.025mol/L氯化钾缓冲液4mL，摇匀，分别在520nm和700nm为吸收波长测定其吸光度值。蓝莓提取液的花青素的浓度按下式计算：

花青素浓度（mg/L）=A/ε×1000×MW×DF

式中：A为最终吸光度，A=（A520nm-A700nm）pH1.0-（A520nm-A700nm）pH4.5；ε：摩尔吸光系数，以矢车菊定-3-葡萄糖苷的摩尔系数进行计算，为26900；MW为矢车菊定-3-葡萄糖苷的摩尔质量，为449.2；DF是稀释倍数；蓝莓提取物中花青素含量最终以1g试样中含有花青素的量（mg）来表示。

1.2.5 蓝莓提取物黄酮含量的测定 黄酮含量采用张 东 升[17]中 NaNO3-Al（NO3）3法 进 行 测 定 ，标 准 曲 线见图3。黄酮含量以每克样品中相当于芦丁的毫克数表示。

1.2.6 清除DPPH自由基的测定 参照Ilhami Gulc等[18]的方法进行改进。无水乙醇配制0.1mmol/L的DPPH溶液，避光保存。用溶剂将样品稀释1000倍，待测。将反应体系充分混匀，室温下避光静置30min。反应结束后，在517nm处测定吸光度值。按照表1进行实验：

图3 蓝莓黄酮测定的标准曲线Fig.3 Standard curve of flavonoid

表1 DPPH实验加样表Table 1 Test sample table of DPPH

按下列公式进行清除率的计算：

式中：A0为未加提取液的DPPH溶液的吸光度，以无水乙醇作空白；A1为加入提取液后DPPH溶液的吸光度，以无水乙醇作空白；A2为提取液与乙醇混合后的吸光度，以无水乙醇作空白。

1.2.7 数据分析 每个实验重复三次，取平均值，用SPSS Statistics20.0处理数据得出差异（p＜0.05）以及用Origin9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 四种北高丛蓝莓提取物的总糖含量

总糖含量是所有糖的总和，包括可溶性糖、大部分单糖和简单的二糖。果实中总糖含量能反映出果实的成熟度和品质状况，能影响蓝莓的口味，因此总糖含量可作为评价蓝莓果实品质的指标之一。从表3可见四种蓝莓的总糖含量在6%~10%之间，存在显著差异性（p＜0.05），其中爱国者的总糖含量最高，接近10%。

表2 蓝莓提取物的总糖含量Table 2 Tte total sugar content of blueberry extracts

2.2 四种北高丛蓝莓提取物的总酚含量

酚类化合物是广泛存在于水果、蔬菜和谷类食物中的植物次生代谢物，是极好的氢供体和电子供体。由于形成的酚类自由基中间体的共振非定域作用以及没有适合分子氧进攻的位置，比较稳定，不会引发新的自由基或自由基链反应而被迅速氧化，因此是很好的抗氧化剂。除此之外，它还有其他的生物活性，尤其在预防心脑血管疾病、癌症以及抗炎症方面发挥着十分重要的作用。由图4可知，四种蓝莓甲醇提取物中总酚含量存在一定的差异性（p＜0.05），说明在同一地区栽培方式相同的情况下，品种之间存在差异性。其中爱国者、北青总酚含量比蓝丰、尼尔森的高，爱国者的总酚含量最高，以没食子酸来计达到1.91mg。

图4 四种蓝莓品种的总酚含量Fig.4 The total phenolic content of four blueberry varieties

2.3 四种北高丛蓝莓提取物的花青素含量

花青素是水溶性单体色素，在植物中常见的有6种，即飞燕草色素、芍药色素、牵牛花色素、天竺葵色素、牵牛花色素和锦葵色素。在自然状态下游离的花青素很少见，常与葡萄糖、半乳糖、木糖等通过糖苷键形成花色苷。有研究表明：花青素是至今为止所发现的最有效的天然水溶性自由基清除剂，其淬灭自由基的能力是VC的20倍，VE的50倍[19]。pH示差法测定了4个北高丛蓝莓品种的花青素总含量，以矢车菊定-3-葡萄糖苷为对照计算，结果如图5。爱国者花青素相对含量最高，达到了0.668mg/g（FW），蓝丰含量最低，仅为0.127mg/g（FW）。四个蓝莓品种中花青素含量之间存在着显著差异性（p＜0.05）。

图5 不同蓝莓品种花青素含量Fig.5 Contents of anthocyanin of different blueberry cultivars

2.4 四种北高丛蓝莓提取物的黄酮含量

黄酮类化合物广泛存在于植物的各个部分，大部分是植物的花、果、叶、茎、皮及根中。很多研究表明黄酮类化合物具有显著的生理药理活性，它能够保护人体免受自由基的损伤，增强血管弹性，改善循环系统，增强免疫力，延缓衰老、抵抗心血管疾病等[20]。由图6可知，爱国者总黄酮含量显著高于其他三个品种（p＜0.05），高达（0.22±0.11）mg/g，其次为北青（0.16±0.03）mg/g，蓝丰和尼尔森总黄酮含量无显著差异。

图6 不同品种北高丛蓝莓黄酮含量Fig.6 Contents of flavonoids of different north highbush blueberry cultivars

2.5 蓝莓甲醇提取物对DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基是一种十分稳定的自由基，它的稳定性主要来自于共振稳定作用及三个苯环的空间障碍，使其中氮原子上的不成对电子不能发挥其应有的电子配对而使吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数呈定量关系。从图7中可以看出，北青与爱国者清除DPPH自由基的能力显著强于蓝丰和奥尼尔。

图7 四种蓝莓对DPPH自由基的清除率Fig.7 Scavenging DPPH free radical’s abilities of four different blueberry cutivars

2.6 蓝莓提取物中总酚、花青素含量与DPPH自由基清除能力的相关性

蓝莓不同品种的清除DPPH自由基的能力不同，这可能与其中多酚含量、花青素含量有关，需将多酚含量、花青素含量与DPPH自由基清除率做相关分析，从而得出其相关性。由图8可知，蓝莓甲醇提取物的DPPH自由基的清除能力与其总酚含量、花青素含量之间存在一定线性关系，清除能力与总酚含量的相关系数为0.9346（R2=0.8735），与花青素含量的相关系数是0.9280（R2=0.8611），说明DPPH清除能力与其总酚含量、花青素含量存在明显的正相关关系，其中与总酚含量的相关性最好，表明蓝莓的抗氧化能力与其酚类物质的含量有关。

3 结论

本研究对四种蓝莓总糖、总酚、花青素、黄酮含量及DPPH自由基清除能力进行分析，结果表明各个品种之间存在着显著的差异性。爱国者总糖含量为9.77%，总 酚 含 量 达 到1.91mg/g，花 青 素 为 0.668mg/g（FW），黄酮含量为0.22mg/g，为四种蓝莓中含量最高。清除DPPH自由基能力最强的品种是北青，从品种的抗氧化能力来评判，种植者可以选择北青这一品种进行栽植，作为高端产品的一个选择。

图8 总酚、花青素含量对DPPH自由基清除能力的相关性Fig.8 Correlation between total contents of phenolics，anthocyanins and DPPH free radical’s scavenge abilities

[1] 植物志编辑 委员 会. 中国植物志[M]. 北 京：北京 科学 出 版社，1991：75-164.

[2] 顾 姻 ，贺 善 安. 蓝 浆 果 与 蔓 越 橘[M]. 北 京 ：中 国 农 业 出 版社，2001：1-6.

[3]孙贵宝. 蓝莓的保健作用及各国栽培发展趋势[J]. 农机化研究，2002（3）：225.

[4]徐静.水果抗氧化活性与成分分析以及对衰老机体抗氧化功能的干预作用[D].北京：中国人民解放军军事医学科学院，2006.

[5]Wu X，Gu L，Prior RL，et al.Characterization of Anthocyanins and Proanthocyanidins in Some Cultivars of Ribes，Aronia，and Sambucusand Their Antioxidant Capacity[J].J Agric Food Chem，2004，52（26）：7846-7856.

[6]Fitzpatrick DF， Bing B， Maggi DA， et al.Vasodilating procyanidins derived from grape seeds[J].Ann N Y Acad Sci，2002，957：78-89.

[7]Lacombe A，Wu VCH，Tyler S，et al.Antimicrobial action of the American cranberry constituents；phenolics，anthocyanins，and organic acids，against Escherichia coli O157∶H7[J].International Journal of Food Microbiology，2010 ，139（1-2）：102-107.

[8]Wilms LC，Hollman PC，Boots AW，et al.Protection by quercetin and quercetin-rich fruit juice against induction of oxidative DNA damage and formation of BPDE-DNA adducts in human lymphocytes[J].Mutat Research，2005，582（1-2）：155-162.

[9]Matchett MD，MacKinnon SL，Sweeney MI，et al.Blueberry flavonoids inhibit matrix metalloproteinase activity in DU145 human prostate cancer cells[J].Biochemistry and Cell Biology-Biochimie Et Biologie Cellulaire，2005，83（5）：637-643.

[10]刘文旭，黄午阳，曾晓雄，等.草莓、黑莓、蓝莓多酚类物质及其抗氧化活性研究[J]. 食品科学，2011，32（23）：130-133.

[11]刘翼翔，吴永沛，陈俊，等.蓝莓不同多酚物质的分离与抑制 细 胞 氧 化 损 伤 功 能 的 比 较 [J]. 浙 江 大 学 学 报 ，2013，39（4）：428-434.

[12]王静，马养民，逯文静.蓝莓花青素的纯化及镇痛、抗炎药效学研究[J]. 食品工业科技，2013，34（5）：338-340.

[13]陈健，孙爱东，高雪娟，等.蓝莓花青素的提取及抗氧化性的研究[J]. 北京林业大学学报，2011，33（2）：126-129.

[14]刘小莉，周剑忠，单成俊，等.蓝莓叶总黄酮的微波提取及抗氧化活性研究[J]. 食品研究与开发，2011，32（3）：44-47.

[15]Suarez B，Alvarez AL，Garcia YD，et al.Phenolic profiles，antioxidant activity and in vitro antiviral properties of apple pomace[J].Food Chemistry，2010，120（1）：339-342.

[16]Mónica Giusti M，Ronald E，Wrolstad.Characterization and Measurement of Anthocyanins by UV-Visible Spectroscopy[J]. Current Protocols in Food Analytical Chemistry，2001：F1.2.1-F1.2.13.

[17]刘玮，钱慧碧，辛秀兰，等.蓝莓果渣中总黄酮的提取纯化及抗氧化性能的研究[J].食品科技，2011，36（2）：216-219.

[18]Gulcin I，Huyut Z，Elmastas M，et al.Radical scavenging and antioxidant activity of tannic acid[J].Arabian Journal of Chemistry，2010，3（1）：43-53.

[19]胡雅馨，李京.蓝莓果实中主要营养及花青素成分的研究[J]. 食品科学，2006，27（10）：3.

[20]徐守霞，王斌，赵志东.蓝莓中黄酮化合物提取影响因素的研究[J]. 赣南师范学院学报，2009（6）：72-75.

Study on the antioxidant ability of four varieties of Northern highbush blueberry extracts

ZHU Ying1，SUN Xiao-hong1，*，JIANG Wen-jie1，ZHAO Yong1，Vivian C.H.Wu2，PAN Ying-jie1
（1.Collage of Food Science ＆ Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing&Preservation，Shanghai 201306，China；2.School of Food and Agriculture，University of Maine，ME 04469-5735，USA）

The total sugar content，total phenolic content，total anthocyanins content and total flavonoids content of four kinds of highbush blueberries methanol extracts were determined through UV-spectrophotometer method.The scavenging DPPH free radical ability of four kinds of blueberries extracts were investigated by in vitro assay.The results demonstrated that Pariot had the highest contents of sugar，phenolics，anthocyanins and flavonoids among the four blueberry cultivars collected at the same time and place ，and the value was 9.77% ，1.91mg/g，0.668mg/g and 0.22mg/g respectively.Nelson had the lowest contents of sugar，phenolics，anthocyanins and flavonoids.The four kinds of methanol extracts of blueberries showed different scavenging abilities against DPPH free radicals.Paroit and Northblue had better DPPH free radical scavenging ability，the value could reach above 30%and the positive correlation among the antioxidant capacity and the content of phenolics，anthocyanins were observed.

blueberry；total sugar；total phenolic；anthocyanin；flavonoid；antioxidant

TS201.4

A

1002-0306（2014）22-0119-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.018

2014－03－13

朱颖（1989-），女，硕士研究生，研究方向：功能食品的开发与利用。

* 通讯作者：孙晓红（1979-），女，博士，副教授，研究方向：食品安全与食品微生物。

上海市科技兴农重点攻关项目（沪农科攻字2014第3-5号）；上海海洋大学科技发展专项基金（A2-0209-14-200061）；上海市科委工程中心建设（11DZ2280300）。