黄海大头鳕胚胎发育过程

于道德, 刘 名, 刘洪军, 姜云荣, 官曙光

(1. 山东省海水养殖研究所, 山东 青岛 266002; 2. 上海海洋大学, 上海 201306; 3. 中国水产科学研究院黄海水产研究所, 山东 青岛 266071)

黄海大头鳕胚胎发育过程

于道德1, 刘 名1, 刘洪军1, 姜云荣2,3, 官曙光1

(1. 山东省海水养殖研究所, 山东 青岛 266002; 2. 上海海洋大学, 上海 201306; 3. 中国水产科学研究院黄海水产研究所, 山东 青岛 266071)

驯化野生大头鳕(Gadus macrocephalusTilesius)作为亲鱼, 通过自然受精和人工授精两种方法获得受精卵, 自然受精卵通过虹吸法收集。受精卵孵化条件为水温6～8℃, 盐度32～33, pH7.8～8.2, 微充气。在奥林巴斯SZ61解剖镜下对大头鳕的胚胎发育进行了观察, 并使用CCD图像传感器拍照, 描述了各发育时期的发育时序和形态特征。大头鳕受精卵为圆球形端黄卵, 弱黏性, 无油球, 卵膜上具龟裂结构, 卵子直径0.95～1.12mm,n=30, 卵黄均匀透明。类似于大部分硬骨鱼类, 其胚胎发育可分为胚盘形成期、卵裂期、桑椹期、囊胚期、原肠期、神经胚期、器官发生期、尾芽期、肌肉效应期。在水温6～8℃, 盐度32～33的条件下, 受精卵历时约336h完成胚胎发育过程, 孵化出膜。在大头鳕胚胎发育过程中, 具有4个不同于其他硬骨鱼类的地方:(1)发现早期分裂球具有不规则现象; (2)很多胚胎发育过程不出现柯氏囊, 有柯氏囊的胚胎仅占 10%左右, 且出现晚, 消失快; (3)胚胎孵化为仔鱼与发育进程关联性不大, 孵化的仔鱼有3种主要形态; (4)胚胎各个时期都有较高死亡率, 以原肠期最为严重。

大头鳕(Gadus macrocephalusTilesius);胚胎发育; 柯氏囊

大头鳕(Gadus macrocephalusTilesius), 英文名太平洋鳕鱼(Pacific cod), 属鲈形目(Perciformes)、鳕科(Gadidae)、鳕属(Acanthopagrus) , 与大西洋鳕鱼(G. morhua)、格陵兰鳕鱼(G. ogac)共同组成鳕属的3种鱼类, 都分布于高纬度低温区域。大头鳕主要分布于北太平洋海域的大陆架, 除了白令海峡、日本海域外,还包括我国的黄海北部。其中大西洋鳕鱼由于过度捕捞而导致资源崩溃, 目前已成为红色濒危物种;如不考虑合理开发和保护, 大头鳕可能面临同样风险。尤其是黄海群体几乎是隔离种群, 其遗传多样性水平较低[1]。近期调查结果显示黄海大头鳕年龄结构仍然较为简单, 且其分布范围较窄, 资源易受外界环境变化的影响[2]。然而我国黄海大头鳕资源量尚可,加上市场价格不高(大头鳕在青岛当地俗称大头腥, 2013年春节期间的市场价格仅在6～10元/kg), 因而并未引起足够重视。基于上述因素, 开展大头鳕苗种人工繁育研究, 提前做好濒危或临近濒危品种的人工繁育和养殖研究, 并为该鱼的增殖放流做好前期工作是科研人员应该首要考虑的问题。

日本学者很早开始关注大头鳕, 研究了其繁殖行为学[3]、运动生理[4]等。国内对大头鳕也进行了基础生物学的研究, 包括摄食食性[5], 种群遗传学[1],而相关人工繁育尚无报道, 尽管卞晓东[6]对大头鳕的早期发育进行了相关报道, 但由于实验是在日本进行的, 且为日本群体, 故该项研究被认为是国内空白。作者对黄海大头鳕的人工繁育进行了探索, 就其胚胎发育过程进行了翔实的描述, 以期为后续规模化人工繁育的开展提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 亲鱼收集和驯化

2013年1月22日, 采用流刺网在青岛近海捕获大头鳕54尾(体长40～60cm), 运至日照东港区海福育苗场。于6m×6m×1.2m水泥池中暂养, 气泵充气, 25W瓦白炽灯控光, 氟苯尼考3×10−6药浴, 每2天换水一次,换水量1/3。水温2.4℃, 盐度28。暂养期间不投饵。

1.2 自然产卵与人工授精

2013年2月11日、2月27日, 大头鳕自然产卵,当时水温为3～4℃; 分别于2月28日、3月7日和3月10日对发育成熟亲鱼各进行了1次人工授精。大头鳕生性平和, 无需麻醉, 便可进行人工授精, 成熟较好的亲鱼, 在操作过程中, 其精液和卵子会自然从生殖孔流出, 仅需轻压腹腔即可获得大量精卵,采用湿法授精。2～3kg的雄鱼, 精液量为100～280mL, 2～3kg雌鱼怀卵量为700～1200mL。

1.3 受精卵及孵化条件

由于大头鳕的卵子具有弱黏性, 无油球, 属于沉性卵, 自然产的受精卵停气后通过虹吸法用网袋收集, 利用孵化网箱放入恒温水池进行流水孵化,受精卵孵化条件为水温 6℃±0.5℃, 盐度 32～33, pH 7.8～8.2, 网箱外充气。人工授精的卵子放入自制孵化网箱内充气孵化, 孵化条件与自然产的受精卵相同。孵化网箱规格为2.4m×1m×0.8m。

1.4 观察方法

参照文献报道, 在孵化前期, 3 h观察一次, 原肠期后, 每天观察3次。使用奥林巴斯SZ61解剖镜观察胚胎发育, 记录发育各时期的形态特征;使用CCD图像传感器和SONY H-50相机拍照; 使用DN-2显微图像处理软件, 结合目微尺、台微尺测定卵径, 每次观察胚胎 3组, 每组至少 30枚。发育时间的确定按照受精卵 50%以上达到该时期界定。

2 结果

大头鳕卵属端黄卵, 为无油球的沉性卵, 由于具有弱黏性, 人工授精后, 在孵化网箱中会自然黏合在一起形成卵团, 但流水轻冲洗, 即可散开。卵膜具龟裂结构, 卵黄均匀无色。卵径为0.95～1.12mm。大头鳕受精卵行盘状卵裂。在水温6℃±0.5℃, 盐度33的条件下, 受精后2h可以看到帽状胚盘, 随后胚盘继续高隆; 受精后7 h开始第一次卵裂, 卵裂期共历时24h。受精后35h胚盘细胞开始下包并内卷, 胚胎发育进入原肠胚阶段, 此阶段是胚体发育中变化最剧烈的时期, 但是胚体雏形出现的时序较晚, 且不清晰。70h达到原口关闭前期, 胚胎下包90%以上,少数具卵黄栓, 但仅个别胚胎出现克氏囊KV(Kupffer’s vesicle, KV), 胚体仅具雏形, 头部明显, 个别胚体清晰可见。110h原口完全闭合, 胚体形成, 头部明显, 眼泡形成, KV囊出现比例不足 10%出。原口关闭后, 胚胎进入器官形成期。受精后192 h,胚体尾芽形成并开始脱离卵黄囊, 受精后210 h胚胎开始出现微弱心跳; 随着胚体进一步发育, 心跳加快, 并伴随着肌体的间歇颤动。在受精后278h, 胚体发育进入到最后的孵化时期, 孵化方式为头部首先破膜。278～336h为孵化期, 不同时间孵化的仔鱼在形态上有区别。其具体发育时序及发育特征见表 1及图1。

3 讨论

3.1 低温发育

作为低温鱼类, 大头鳕的胚胎发育过程十分缓慢, 本研究结果就与国内曾报道过的另一种低温鱼类条斑星鲽相似, 通过对比两种鱼类, 似乎可以从中看出一些低温鱼类胚胎发育的规律性(表2)。大头鳕胚胎发育的主要特征包括细胞分裂速度慢, 尤其是原肠期持续近48h。也正是因为其发育慢, 使得人们可以了解很多不同的过程。不同步卵裂现象提前,而且裂球均一程度差, 这一点与条斑星鲽类似[7]。而且这种不同步性在原口关闭期体现的更为明显, 有的胚胎在该时期具有明显的胚体形成, 头部分化明显, 而大部分在该时期很难分辨胚体所在位置, 需要不断拨动受精卵翻转, 才可以粗略看到, 因此其细胞的下包和内移的过程是分开的, 且速度不同,而对于暖水性鱼类来说, 由于发育速度快无法表现而已。

3.2 黄海大头鳕卵子的物理特性

黄海大头鳕的卵子属无油球、沉性卵, 与日本大头鳕相同[3]。海洋鱼类的卵子, 其油球的有无与卵子的浮性相关, 因为油球的本质为脂肪, 比重轻于海水, 因此具有油球的卵子一般都是浮性卵[8-9]。较高盐度(32～34)下, 无油球的条斑星鲽卵子也呈现漂浮状态[7], 这与卵子最后成熟阶段水化过程相关[10]。本实验3月7日进行的人工授精试验, 发现部分卵子具有浮性, 经过一段时间检测, 为正常发育的卵子, 但是比例很小, 不到1‰。原因可能是由于大头鳕卵子具有弱黏性, 卵子相互黏成团, 间隙中存有气泡导致比重降低的缘故。另外, 通过盐度实验发现, 无论多高的盐度, 即便达到饱和程度(使用海水粗盐调制), 大头鳕的卵子都不具有上浮的特性, 可见大头鳕卵子的密度很大, 主要是卵黄物质致密, 通过图 1 1-29, 1-30, 1-31可以看出卵黄的吸收造成卵黄囊形成缺刻, 而不同于其他硬骨鱼类, 随着发育的进行卵黄囊缩小。作者可以推断, 大头鳕的受精卵在自然界应该沉在海底进行孵化, 其卵黄囊物质是否含有特定的抗压与耐寒成分还需要进一步研究。

表1 大头鳕的发育时序及发育特征Tab.1 Developmental duration and characteristics of Gadus macrocephalus Tilesius embryo

3.3 成熟卵子与黏性

文献报道, 大头鳕的卵子具有弱黏性, 而且与其卵子的成熟度密切相关。作者在进行 3次人工授精的过程中发现: 成熟度最好的一次(3月7日, 受精率高达 92%), 轻压腹部, 卵子自动流出, 在烧杯中呈现流动状态, 与混合其中的卵巢液可轻易倒入塑料盆中, 仅在烧杯壁黏有个别卵子, 其卵子表现为弱黏性。而在2月28日进行的人工授精过程, 卵子黏性很大, 烧杯壁黏满卵子, 流水冲洗也不易剥落,其卵子相互挤压, 为不规则的圆形, 受精率仅 30%,发育至原肠期, 几乎全部停止发育死亡。其究竟为未成熟或者是过熟还不得而知。在3月10日, 进行人工授精与3月7日为同一条雌性亲鱼, 发现卵子仍为弱黏性, 但是受精率已经降低至 1%以下, 卵子表现局部发白, 应该为过熟的卵子(图2)。

图1 大头鳕的胚胎发育Fig.1 Embryonic Development of Gadus macrocephalus

表2 大头鳕与条斑星鲽胚胎发育比较Tab.2 Comparison of embryonic development between Gadus macrocephalus Tilesius and Verasper moseri

通过受精率来判断, 第 1次人工授精中受精率为30%, 应该为发育中尚未达到成熟的卵子, 而第3次肯定是过熟的卵子(因为取自同一条亲鱼)。由此可见, 人工授精时机的把握非常重要, 成熟的卵子在 3天内会失去受精能力, 这与文献报道的不一致。

图2 大头鳕3次人工授精结果对比Fig.2 Comparison of three times artificial insemination of Gadus macrocephalus

3.4 柯氏囊

为纪念Kupffer在1868年发现真骨鱼类胚胎发育过程中会出现一个暂时性的囊泡, 而将其命名为柯氏囊(Kupffer’s vesicle)[11]。近年来研究证实了柯氏囊一个内含单纤毛细胞(monociliated cells)的器官,并且与胚胎发育的不对称性密切相关[12-13]。

硬骨鱼类 KV囊的位置在其尾部的腹侧, 离尾芽还有一段距离, 因此出现的时机一般在原口关闭前或原口刚刚关闭的时期, 随着胚胎的发育, 在尾芽游离前即消失。如条石鲷(Oplegnathus fasciatusTemmine)的 KV囊出现在原口关闭期, 尾芽游离立刻消失[14]。黑棘鲷(Acanthopagrus schlegelii(Bleeker, 1854))的KV囊在原口关闭前期出现, 同样在大头鳕的柯氏囊似乎可有可无, 因为在很多胚胎时期几乎看不到它的存在, 发现最多10%的胚胎具有KV。而且, 即使出现KV的个体, 其出现的时序也要晚于其他硬骨鱼类, 一般硬骨鱼类的 KV出现在原口关闭前期。由此可见, 这个暂时性的囊泡并非所有硬骨鱼类都出现, 而且其作用是否如上所述, 起始了胚胎发育的不对称性还有待进一步考证。在大头鳕胚胎发育过程中大量出现的其他囊泡(图1中的1-20, 1-23, 1-24)的存在是否替代了 KV及其功能呢？也需要进一步证实。

3.5 孵化时期

作为低温孵化期长的鱼类, 其孵化周期也长,这个很容易理解。但是对于其孵化出来的发育时期,却很少有差别。在真鲷、牙鲆等鱼类中, 孵化周期也超过 6h, 但是初孵仔鱼的形态, 尤其是体色模式规律性很强, 发育时期也大体一致。而大头鳕的孵化周期近60h, 初孵仔鱼形态也差异很大, 如图1中1-29,孵化前Ⅱ期的仔鱼, 躯干部并没有形成色素带, 眼球晶体的色素沉积也不完善, 在烧杯中的游动能力很差, 几乎不能正常游动, 这如果归结于其他因素导致的不正常孵化, 也欠缺理论支持, 这样的仔鱼随着发育, 同样可以继续存活。什么因素导致其提前孵化或孵化时机究竟是由什么控制, 还需要进一步探索。

3.6 胚胎高死亡率

在大头鳕胚胎发育过程中, 从卵裂开始, 就陆续出现大量死亡胚胎。本实验最后一次人工授精孵化水温在6℃, 海水盐度等理化因子没有任何问题。从二细胞计算, 受精率高达 92%, 但是到了原口关闭期, 仅存活 54%左右, 并存在大量畸形发育的胚胎。临近孵化前期, 仅存20%正常的胚胎, 最终的孵化率在15.8%。在胚胎发育过程中的高死亡率并无具体的敏感期, 其外界影响因素也不清楚。在收集到的自然受精的胚胎中, 孵化率更是低至 5%以下, 这种胚胎期的高死亡率是否与遗传机制相关, 而雌雄个体较高的绝对繁殖力似乎是弥补其胚胎高死亡率的进化对策之一, 卞晓东[6]在日本的实验证实4～6℃是其孵化的最适温度。这是否与需要低温孵化, 而作者的孵化温度过高导致的高死亡率还要进一步证实,尤其是在3月11日遭遇高温天气(车间无降温设备),池水温度达到8℃, 也可能是其高死亡率的外界诱因之一。

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(本文编辑: 梁德海)

The Embryonic Development ofGadus macrocephalusTilesius

YU Dao-de1, LIU Ming1, LIU Hong-jun1, JIANG Yun-rong2,3,GUAN Shu-guang1
(1.Mariculture Institute of Shandong Province, Qingdao 266002, China; 2. Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Yellow sea fisheries research institute chinese recedemy of fishery sciences, Qingdao266071, China)

Jun., 28, 2013

Gadus macrocephalusTilesius; embryonic development; Kupffer’s vesicle

The fertilized eggs of wild broodstock,Gadus macrocephalusTilesius wereacquired through two methods, natural fertilization and artificial insemination. The naturallyfertilized eggs collected by flooding assay. The fertilized eggs were incubated in filtered sea water at 6～8℃, salinity 32～33, pH7.8～8.2, with subtle aerated. The ontogenetic embryos were observed using a Olympus SZ-61 microscope.The total development time of every stage was noted and calculated and the characteristic images were taken using a charge-coupled device(CCD). The fertilized eggs were globular, single oil globule and the egg diameter was 0.95～1.12mm(n=30). The embryonic developmentexperienced 336h including blastodisc stage, cleavage stage, blastula stage, gastrula stage, neurula stage, organogenesis stage, tail bud stage, heart beating stage and hatching stage.We found there were significant differences betweenGadus macrocephalusTilesiusand other teleost in some stages:1) unregular blastomeres in early cleavage; 2) devoid of Kupffer’s vesicle in most embryos during development, only 10% embryos could be observed and occurred later and disappeared earlier than other teleost; 3) the newly-hatched larvae were not related with certain developing stage, and there were three major ontogenetic patterns when the larvae hatched; 4) it has a high death rate during all the development stages, especially in gastrula stage.

S917.4; Q959.4

A

1000-3096(2014)03-0080-07

10.11759/hykx20110506001

2013-06-28;

2013-10-10

山东省科技发展计划项目(2013GHY11509)

于道德(1978-), 男, 博士, 山东青岛人, 主要从事鱼类学研究, 电话: 0532-82655167, E-mail: 18660297029@163.com; 官曙光, 通信作者, 硕士, 主要从事鱼类学研究, 电话: 13156263778