虾蟹壳氨基葡萄糖-半胱氨酸美拉德反应产物对酪氨酸酶的抑制作用

林晓彰, 刘必谦, 周湘池, 章思思, 庄 怡

(宁波大学 海洋学院 应用海洋生物学教育部重点实验室, 浙江 宁波 315211)

虾蟹壳氨基葡萄糖-半胱氨酸美拉德反应产物对酪氨酸酶的抑制作用

林晓彰, 刘必谦, 周湘池, 章思思, 庄 怡

(宁波大学 海洋学院 应用海洋生物学教育部重点实验室, 浙江 宁波 315211)

为了探讨半胱氨酸-氨糖美拉德反应产物(GCMRPs)对酪氨酸酶催化活性的影响及其在对虾冷藏保鲜中的作用, 以半胱氨酸及虾蟹壳氨基葡萄糖盐酸盐为原料, 在碱性条件下(pH=10)制备美拉德反应产物, 并分别测定其酪氨酸酶二酚酶活抑制能力及对南美白对虾黑变腐败的影响。结果显示, GCMRPs具有很强的二酚酶活抑制能力, 对酪氨酸酶二酚酶活的抑制类型为不可逆的竞争性抑制。通过比较, 在同浓度下, 其抑制酪氨酸酶二酚酶活能力比半胱氨酸、曲酸更为优越, 可做为一种有效的酶抑制剂。同时, 鲜虾保鲜实验显示该产物有很好的防止黑变的能力, 且有一定的防腐能力。

酪氨酸酶; 半胱氨酸; 氨糖; 美拉德反应产物; 抑制; 黑变

酪氨酸酶是一种含铜氧化酶, 是催化人体黑色素生成的重要酶类, 同时也是蔬菜水果及虾蟹类产品在储藏过程中产生褐变黑变现象的主要酶类[1]。酪氨酸酶主要存在于人体的黑色素细胞中, 机体受外界刺激(紫外)或自身产生的过激反应, 均会造成酪氨酸酶的活性被大量激活, 使人体皮肤产生黑色素沉着现象, 形成雀斑、黄褐斑、老年斑等普遍的皮肤问题, 影响面容美观, 给人们造成一定的心理压力而间接影响其生活质量[2]。同时, 酪氨酸酶影响农作物以及虾蟹类色泽, 从而降低其营养价值和经济价值[3-4]。因此, 酪氨酸酶抑制剂的研发对农业及祛斑产品行业具有重要意义。

目前, 已有大量的酪氨酸酶抑制剂被用作化妆品美白成分的报道, 如氢醌、熊果苷、曲酸、甘草黄酮等[5-6]。但这些市场上常见的酪氨酸酶抑制剂不稳定, 易氧化, 光敏性强, 且部分抑制剂有致癌的潜在危险[7-9], 因此, 开发安全稳定的酪氨酸酶抑制剂十分必要。美拉德反应是由还原性糖类(羰基)物质与带游离氨基物质(蛋白质、多肽、氨基酸)发生的一种非酶褐变反应, 在食品加工过程中能形成种类繁多的风味物质[10], 且其在反应过程中产生大量还原性酮类物质, 具有一定的金属螯合能力[11-12], 可做为酪氨酸酶抑制剂筛选的重要研究对象。本研究以氨基葡萄糖和半胱氨酸两种安全无毒的原料制备美拉德反应产物, 并对其酪氨酸酶抑制活性及抗黑作用进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

氨基葡萄糖盐酸盐购自浙江金壳海洋生物化学有限公司; 酪氨酸酶购自美国 Worthington公司; L-DOPA购自sigma公司; 曲酸、半胱氨酸、硼酸等试剂均为分析纯; 保鲜实验的南美白对虾购自宁波欧尚超市。

1.2 实验方法

1.2.1 GCMRPs的制备

GCMRPs的制备方法参考文献[13], 并略作修改。精确称取一定量等摩尔半胱氨酸及氨基葡糖盐酸盐, 溶于 0.1mol/L硼酸盐缓冲液(pH=10.0)中, 使其浓度为20 mmol/L, 105℃油浴加热8 h。待反应完全后, 溶液呈黄色, 立即冰水浴冷却, 4℃保存备用。

1.2.2 GCMRPs二酚酶活抑制能力测定

酪氨酸酶二酚酶活抑制能力测定参考文献[14],并略作修改。以GCMRPs延缓L-DOPA生成红色物质多巴醌的速率大小来测定二酚酶活抑制作用, 其中多巴醌在 475nm 有最大吸收峰。取不同体积GCMRPs样液于0.6 mL 5mmol/L L-DOPA溶液中,并以 0.25mol/L磷酸钾缓冲液(pH=6.5)补至 2.8 mL, 30℃水浴10 min。加入30℃预热的200 μL 250 U/mL酪氨酸酶后, 立即混匀记录 10 min内A475的变化(ΔA475), 每30 s记录1次。以同浓度氨基葡萄糖-半胱氨酸未加热混合物(Unheated Mix)、以及曲酸(KA)做参照, 以不加样品为空白对照, 记 1 min内样品ΔA475为Aj, L-DOPA自氧化 ΔA475为Ai, 空白对照ΔA475为A0, 计算相对酶活率, 其公式如下:

1.2.3 GCMRPs对酪氨酸酶的抑制类型测定

在测酶活体系中, 固定底物浓度, 改变酶添加量, 测定不同GCMRPs添加量对酶催化速率的影响,以酶活为横坐标, 催化速率为纵坐标, 建立曲线, 分析GCMRPs抑制剂类型。

在测酶活体系中, 固定酶活为 50U, 改变底物L-DOPA的浓度c, 测定不同浓度GCMRPs添加量对酶催化速率v的影响, 以1/c为横坐标, 1/v为纵坐标, 建立Lineweaver-Burk 曲线, 分析GCMRPs的抑酶机制。

1.2.4 GCMRPs对鲜虾冷藏过程中黑变的影响

以南美白对虾为实验对象, 通过观察产物虾体黑变情况评估GCMRPs抗黑变能力。清水洗净南美白对虾后, 沥干后, 以虾液比 1∶2(W/V)浸于 20 mmol/L GCMRPs溶液中10 min, 取出沥干后, 装盘, 以保鲜膜封好, 4℃冰箱冷藏。以不处理的南美白对虾为对照组, 以含同浓度半胱氨酸、氨基葡糖盐酸盐溶液为阳性参照。每隔3 d观察一次鲜虾虾体黑变情况, 每次进行黑变感官评分, 共计 12 d, 每次进行黑变感官评分。评分标准参考Phonpala等[15]人的方法并略作修改, 评估方法如下: 0=未黑变; 2=20%头胸甲黑变; 4=40%头胸甲黑变; 6=60%头胸甲黑变; 8=80%头胸甲黑变并有轻微足黑变; 10=头胸甲完全黑变, 且躯干足有明显黑变。

1.2.5 挥发性盐基总氮(T-VBN)测定

TVB-N 的测定采用GB/T 5009.44-2003 中 4.1的方法。

1.2.6 细菌总数(TVC)测定

细菌总数测定参考 GB/T 4789.2003, 菌落总数测定法。

1.2.7 二氧化硫含量测定

亚硫酸盐测定参考GB/T 5009.34-2003《食品中亚硫酸盐的测定》中蒸馏法。

2 结果

2.1 GCMRPs对酪氨酸酶二酚酶活抑制作用

从图1可以看出, GCMRPs对酪氨酸酶的抑制作用为浓度依赖型, 即随着其 GCMRPs浓度增加, 酪氨酸酶二酚酶相对酶活逐渐降低, 而相应的酶促反应延滞时间有显著的增长。当GCMRPs添加量7.5μL时, 酶活降低99.46%, 延滞时间达到132 s, 而参照物同浓度Unheated Mix酶活降低率只有68%, 延滞时间28 s, 说明GCMRPs中存在酪氨酸酶强抑制剂,其抑制效率远比Unheated Mix高。

图1 不同浓度GCMRPs对二酚酶活及延滞时间的影响Fig.1 Effect of GCMRPs on relative activity and lag time of tyrosinase

以1 mmol/L L-DOPA为底物, 比较GCMRPs与同浓度曲酸以及半胱氨酸对酪氨酸酶二酚酶活抑制能力, 结果如图2所示。15 μL GCMRPs在10 min内能基本完全抑制住酶促反应, 其10 min内的ΔA475为0.003, 而相应的Unheated Mix及KA 10 min内的吸光值变化分别为0.248, 0.163。可见GCMRPs的抑酶能力更强。

图2 GCMRPs对酪氨酸酶二酚酶活的抑制曲线Fig.2 Progress curves for inhibition of tyrosinase by GCMRPs

2.2 GCMRPs对酪氨酸酶的抑制机理

固定酶量, 改变底物浓度, 研究不同 GCMRPs添加量对酶活的作用, 如图 3所示, 其中检测用GCMRPs添加量分别为1.5、3.0、4.5 μL。从图3可知, 经双倒数法获得的直线相交于纵坐标同一点,且随着 GCMRPs浓度不断增大, 截距逐渐减小,Km逐渐变大, 说明GCMRPs对酪氨酸酶的抑制类型为竞争性抑制。

图 3 GCMRPs对酪氨酸酶抑制作用的 Lineweaver-Burk曲线Fig 3 Lineweaver-Burk plot for inhibition of mushroom tyrosinase by GCMRPs

图4反映了酪氨酸酶经GCMRPs处理后, 其有效酶活催化速率与酶量的关系, 以有效酶活催化速率对酶量作图得到一组斜率为0.0033的相互平行的直线, 说明 GCMRPs对酪氨酸酶的抑制作用是不可逆的, 这说明 GCMRPs可能是减少有效酶量来抑制催化反应的。

图4 GCMRPs对酪氨酸酶二酚酶活的抑制机理曲线Fig 4 Curve for inhibition mechanism of diphenolase activity of mushroom tyrosinase by GCMRPs

2.3 GCMRPs对南美白对虾的冷藏效果的影响

以20 mmol/L GCMRPs浸泡南美白对虾, 4℃冷藏, 研究GCMRPs对南美白对虾黑变的影响(图5)。从图5可知, GCMRPs对南美白对虾的黑变有很好的抑制作用, 对照组未作处理的南美白对虾在9 d后基本完全黑变, 而GCMRPs只有少许黑变, 在保藏12 d后, 其黑变指数为2.33。此外, 以同浓度为Unheated Mix处理的鲜虾, 在前3 d有一定的抑制作用, 但其后黑变程度明显上升。经GCMRPs处理的鲜虾虾体黑变增长缓慢, 与该产物对酪氨酸酶的抑制作用相一致。

图5 GCMRPs对南美白对虾黑变得分的影响Fig.5 Effect of GCMRPs on melanosis score of Pacific white shrimp

2.4 GCMRPs对南美白对虾冰藏过程中T-VBN的影响

经不同方式处理的南美白对虾在冷藏过程中T-VBN的变化见图6。经GCMRPs处理能有效减小南美白对虾虾体T-VBN量, 且在12 d内保持鲜虾不产生或仅产生少许腐败胺类气味, 第 9 天 T-VBN含量为 35.8 mg/100 g, 略超食品安全规定范围(30 mg/100 g)。Unheated Mix处理的鲜虾在一定程度上抑制了 T-VBN 的生成, 但其抑制能力小于GCMRPs。同时, 未经任何处理的鲜虾, 其T-VBN量随着冷藏时间的推移, T-VBN出现大幅度增长, 第6天后T-VBN达47.1 mg/100 g远超食品安全规定范围,腐败气味明显, 第12天后, 肉质糜烂, 具恶臭。

图6 GCMRPs对南美白对虾冰藏过程中T-VBN变化的影响Fig.6 Effect of GCMRPs on T-VBN of Pacific white shrimp

2.5 GCMRPs对南美白对虾冰藏过程中TVC的影响

图7为南美白对虾在4℃冷藏过程中的细菌总数变化。虾体自身带有大量的细菌, 其细菌含量log值达 4.25, 在冷藏过程中, 虾体细菌总数都出现增长趋势。其中未处理组第3天后, 细菌总数就有明显增加, 其log值增至5.114; GCMRPs组细菌增殖不明显,并以一个较平缓的增长趋势增加, 但在第 9天有一个较为明显的增长幅度。同时, 在整个冷藏过程中, GCMRPs组的细菌总数均比Unheated Mix组低。

3 讨论

3.1 美拉德反应产物可作为酪氨酸酶抑制剂研究对象

酪氨酸酶是一种氧化酶类, 其活性位点含两个铜离子, 因此国内外学者指出酪氨酸酶的抑制机理可能与抑制剂的抗氧化性、金属螯合能力有关。美拉德反应产物具有一定的还原能力、清除自由基能力以及金属螯合能力[12,16], 同时被广泛运用于食品添加剂中, 且已有报道美拉德反应产物中具有促进人体健康的物质[17], 因此可做为研究酪氨酸酶抑制剂的重要研究对象。

图7 GCMRPs对南美白对虾冰藏过程中TVC变化的影响Fig.7 Effect of GCMRPs on TVC of Pacific white shrimp

3.2 GCMRPs可有效抑制酪氨酸酶, 其抑制类型为不可逆竞争性抑制

目前, 关于半胱氨酸-还原性糖的美拉德反应产物对酪氨酸酶的抑制作用也有报道。研究显示, 以葡萄糖-半胱氨酸反应模式所得MRPs对酪氨酸酶的抑制效率没有未加热的混合物高[18], 但本文 GCMRPs不仅对酪氨酸酶具有显著的抑制作用, 且其反应产物比Unheated Mix的抑制效率更高, 其延滞时间约为Unheated Mix的5倍, 推测该反应体系中氨基葡糖盐酸盐一个额外的氨基基团的引入是造成GCMRPs抑酶特性反差的原因之一。

目前, 酪氨酸酶抑制剂研究领域日益广泛, 许多常见酪氨酸酶抑制剂, 如曲酸、半胱氨酸也已被用于保鲜与化妆品行业。但评价酪氨酸酶抑制效率的强弱常因实验方法不同而难以比较。因此, 常以同浓度下曲酸的抑酶效率做为阳性参照。在同浓度条件下, GCMRPs对酪氨酸酶的抑制作用比曲酸更加优越, 预示了其在抑黑方面的应用前景。

3.3 GCMRPs对南美白对虾具有良好的抑黑变效果

虾体黑变主要是由虾体中的酪氨酸酶和微生物共同作用引起的[19]。因此, 酪氨酸酶抑制剂及抑菌剂在一定程度上能抑制虾体的黑变过程。报道指出美拉德产物不仅对酪氨酸酶具有抑制作用, 且具有一定的抑菌作用[20-21]。而实验结果显示, GCMRPs不仅可有效抑制对虾的黑变, 且可有效抑制虾体中细菌的增殖, 具有一定的防腐效果。虽然 GCMRPs中成分还有待进一步确定, 但有报道含硫化合物形成的美拉德反应产物中存在噻吩、噻唑类等抑菌物质[22],因此GCMRPs的防腐作用可能与这类物质相关。

目前, 我国主要以焦亚硫酸钠作为鲜虾保鲜剂,该成分价格低廉, 且抑黑效果不错, 因此受到虾蟹类生产者的青睐。但焦亚硫酸钠容易造成二氧化硫残留问题, 不仅破坏虾体营养成分, 同时危害人体健康, 因此应尽量避免使用。卓华龙等[23]以3%焦亚硫酸钠浸泡处理海捕虾, -5～-2℃条件下冷藏, 能维持虾体色泽 6 d, 但其二氧化硫残留量高达148.74 mg/100 g(标准要求≤100 mg/100 g)。本实验GCMRPs在较低浓度即能有效抑制9 d, 且其二氧化硫残留量仅为5.38 mg/100 g, 不存在二氧化硫残留超标问题。有部分学者通过GC-MS分析了多种以半胱氨酸为原料的美拉德产物产物中挥发性气体成分,发现所有反应模式的产物均不存在二氧化硫[22,24-25],进一步说明了美拉德反应产物作为抑黑保鲜剂的安全性。GCMRPs是以氨基葡萄糖和半胱氨酸为原料合成, 二者资源丰富, 其加工技术也日趋成熟, 价格也比较低廉, 预示其在保鲜剂上有良好的应用前景。

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(本文编辑: 康亦兼)

Inhibitory effect of glucosamine-cysteine maillard reaction product on tyrosinase

LIN Xiao-zhang, LIU Bi-qian, ZHOU Xiang-chi, ZHANG Si-si, ZHUANG Yi,
(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology of Ministry of Education, School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Mar., 19, 2013

tyrosinase; cysteine; glucosamine; Maillard reaction product; inhibit; melonosis

Research on tyrosinase inhibitors has become a common concern due to the important role of tyrosinase both in mammalian melanogenesis and fruit or shrimp enzymatic browning. In this paper, Maillard reaction products prepared by heating glucosamine hydrochloride-cysteine model in alkaline condition (GCMRPs) were studied for their tyrosinase inhibition activity and effect on quality of shrimp during ice-storage. The results showed that, this compound was an irreversible competitive inhibitor exhibiting a higher inhibitory effect than cysteine and kojic acid at the same concentration. In addition, the effect of GCMRPs on quality of pacific white shrimp during ice-storage was investigated. Shrimp treated with 20 mmol/L GCMRPs exhibited lower melanosis score and total viable count compared with those without treatment throughout the storage period.

Q554

A

1000-3096(2014)03-0014-06

10.11759/hykx20130319002

2013-03-19;

2013-06-25

宁波市科技计划项目(2006B100069)

林晓彰(1989-), 男(汉族), 浙江温州人, 硕士研究生, 主要研究方向为糖类衍生物酪氨酸酶抑制活性, E-mail: evilforcelin @163.com; 刘必谦, 通信作者, 研究员, E-mail: lbqhy@nbu.edu.cn