不同色素兔光化学法诱导视网膜静脉阻塞模型的对比

乔朱一飞 李明新

·基础研究·

不同色素兔光化学法诱导视网膜静脉阻塞模型的对比

乔朱一飞 李明新

目的 观察并比较光化学法诱导不同色素兔视网膜静脉阻塞(RVO)模型的各自特点与差异。方法 普通级有色素兔和日本大耳白兔各10只。经兔耳缘静脉注入孟加拉红(40 mg/kg)后，应用倍频532激光光凝兔双眼视网膜静脉主干，制作视网膜静脉阻塞模型。所有实验兔分别于术前和光凝后15 min，1、3、7、14、21、28 d行眼底彩照和荧光素眼底血管造影(FFA)检查，并于光凝后1 d，2组各选取2只模型兔处死，摘除眼球行病理组织切片检查，观察比较不同色素兔眼底的损伤是否存在差异；其余于光凝后28 d处死，摘除眼球行光学显微镜检查。结果 2组实验兔光凝后均立刻出现视网膜血流阻断现象。光凝后1 d，日本大耳白兔出现显著的视网膜水肿和少量视网膜下出血，普通有色素兔则表现为视网膜下火焰状出血和较为明显的视网膜水肿。2组FFA均显示视网膜两侧动静脉主干血流被阻断。2组实验兔在1～3周时，光凝点部位血管均出现不同程度的再通，视网膜出血水肿逐渐吸收。4周时血管基本再通，FFA示普通有色素兔光凝部位血管周围出现小范围的无灌注区、色素紊乱以及血管形态的异常。病理切片显示，光凝术后1 d，日本大耳白兔脉络膜中可见血栓形成，而普通有色素兔则无此现象。2组实验兔均可观察到外层视网膜水肿。光凝后28 d，2组实验兔均可观察到视网膜神经节细胞核密度减少。结论 通过光化学诱导法，普通有色素兔及日本大耳白兔均可成功建立RVO模型。但不同色素兔使用相同激光能量制作RVO模型，眼底损伤部位存在差异。在眼底彩照和FFA检查上，2组有显著区别，且日本大耳白兔显影较差。(中国眼耳鼻喉科杂志，2014，14：171-176)

光化学法； 视网膜静脉阻塞； 色素

视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion，RVO)是仅次于糖尿病视网膜病变的第二大致盲性眼底血管性疾病，常引起黄斑水肿、玻璃体出血、新生血管性青光眼及视网膜脱离等并发症，对患者视功能的损害较为严重[1]。临床上根据RVO部位主要分为中央静脉阻塞(central RVO，CRVO)、分支静脉阻塞(branch RVO，BRVO)，其中CRVO后果更为严重，许多患者的视力最终降到法定盲以下[2]。因此，建立具有良好可重复性，并能呈现与该病病理过程相类似的动物模型来进行病因学、病理学和治疗学方面的研究非常必要。

目前制作RVO模型主要是血管结扎法、透热法、凝血酶静脉滴注法、玻璃体腔内注入内皮素-1法、激光光凝封闭视网膜静脉法、光化学法[3]。其中光化学法是将光敏药物注入静脉后，激光照射欲阻断的视网膜血管，在光敏药物与照射激光的共同作用下，通过一系列级联反应导致血小板聚集形成血栓，与人RVO的静脉血栓成分及形成机制相近似，操作简便且对动物眼球损伤小，成为目前制作RVO模型的主要方法[4-6]。兔子由于价格低廉，眼球较大，视网膜动、静脉血管利于观察，在RVO的研究中被大多数学者选为模型动物。

在光化学法制作RVO模型的研究中，白兔和有色素兔都曾作为实验兔在文献中报道[7-9]。而激光光凝对眼球的损伤与眼底色素的多少有关，受照组织色素含量越高，对光能的吸收越强，越易受到激光损伤。此光损伤的一般规律在光化学法制作RVO模型的过程中，对于不同色素兔会有哪些不同的影响，文献报道较少。本实验采用光化学法，选取不同色素兔制作RVO模型，通过眼底彩照、荧光素眼底血管造影(fluorescence fundus angiography，FFA)、组织病理学检查，比较不同色素兔光化学法诱导RVO模型的各自特点和差异，为以后的研究提供有用和可行的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康成年日本大耳白兔及普通有色素兔各10只，体质量2.0～2.5 kg，雌雄不拘，动物生产许可证号为SCXK(苏)2010-0003，使用许可证号为SYXK(苏)2010-0011。实验在徐州医学院实验动物中心进行。实验前均经裂隙灯显微镜及眼底检查，排除动物双眼屈光介质或眼底异常。

1.1.2 实验试剂及主要设备 孟加拉红钠盐(上海金穗试剂公司进口分装)，戊巴比妥钠(上海化学试剂公司)配成3%溶液，荧光素钠注射液(Cardinal Health Manufacturing Services B.V.，美国)；0.22 μm无菌滤过器(Millipore，美国)，眼底照相及眼底荧光造影设备(EOS-1Ds Mark II，佳能，日本)，倍频532激光(VISULAS532S，蔡司，德国)，光学显微镜(906尼康DS-Ril正置荧光显微镜)。

1.2 建立模型 孟加拉红钠盐用生理盐水配制，质量浓度为50 mg/mL，经0.22 μm无菌滤过器过滤，现配现用。普通有色素兔及日本大耳白兔各10只，双眼均设为实验眼。经复方托吡卡胺滴眼液充分扩瞳后, 3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉(1 mL/kg)，双眼滴入盐酸奥布卡因滴眼液表面麻醉，经耳缘静脉一次性注射盂加拉红40 mg/kg，数秒后放置角膜接触三面镜。光凝点选在静脉主干离视盘0.5～1 DD处，避开伴行动脉。选定激光照射的光凝点，光斑大小为100 μm，曝光0.5 s，激光能量150 mW。光凝双侧视网膜静脉主干40点后，为防止血管的快速再通，300 mW再光凝40点。光凝后15 min，行FFA及眼底拍照，确认静脉阻塞形成。

1.3 观察指标

1.3.1 眼底彩照及FFA 2组实验兔均于造模后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d行眼底照相及FFA检查。复方托吡卡胺滴眼液扩瞳，行眼底彩照，观察眼底的变化情况；并在耳缘静脉注射荧光素钠(0.1 mL/kg)行FFA检查，观察眼底RVO情况。其中普通有色素兔每只眼至少拍摄5张图像，包括：视盘、颞侧分支、鼻侧分支、视盘上方的视网膜、视盘下方的视网膜。日本大耳白兔组显影效果不佳，只拍摄视盘附近视网膜。

1.3.2 组织病理学检查 激光光凝后1 d，经眼底彩照及FFA确认造模成功后，每组随机取2只兔子，用空气栓塞法处死；立即摘出眼球，放入10%多聚甲醛固定液中固定1周；作平行于眼球矢状面的厚度为 4 μm的连续切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察。剩余实验兔做后续观察，并于实验结束后用同样方法处、死摘除眼球，行病理学切片检查。

2 结果

2.1 眼底彩照及FFA 所有兔子在接受光凝后，都立即出现静脉血流停滞或者是静脉管壁痉挛闭塞，大多数实验兔动脉在光凝静脉的同时也会出现痉挛变细或者血流停滞现象。光凝后15 min，光凝处视网膜静脉闭塞，远端视网膜静脉迂曲，伴行视网膜动脉同时出现血流中断及血管痉挛，有髓神经纤维表面的视网膜水肿，呈现强荧光。

2.1.1 日本大耳白兔组 光凝后15 min，光凝点附近的视网膜水肿、变白，阻塞位点呈相对血管的强荧光。光凝术后1 d，白兔眼底出现显著的视网膜水肿、少量视网膜出血，视网膜两侧动、静脉主干血流均阻断，阻塞点远端静脉淤血、扩张迂曲。光凝后7 d，出血逐渐吸收。14 d后，阻塞血管出现不同程度的再通。值得注意的是, 在眼底彩照中，白兔眼底视盘界限模糊，颜色较暗；摄取眼底造影图像更为困难，无法将各个象限都拍摄下来。所能得到的荧光图像，在脉络膜强背景荧光衬托下，视网膜血管显影较暗，视盘始终呈现为暗区(图1)。

此外，1只模型眼光凝术后1 d出现周边脉络膜脱离现象(图2)。另有2眼在3 d后血管出现再通的现象。

图1. 白兔眼底彩照和FFA的表现 A、B依次是光凝后15 min眼底彩照、FFA；C、D分别是光凝后1 d眼底彩照、FFA(箭头所示为阻塞位点)。可以看到白兔的阻塞位点成相对的强荧光，而血流存在的地方呈相对的弱荧光

图2. 光凝术后1 d日本大耳白兔组周边脉络膜脱离1例 A、B分别为眼底彩照、FFA；脉络膜脱离边界(箭头所示)

2.1.2 普通有色素兔组 光凝后15 min，所有兔眼均出现视网膜静脉闭塞，远端视网膜静脉迂曲，伴行视网膜动脉血流停滞或血管痉挛，其中2眼视网膜血管破裂，并引起轻度玻璃体出血，出血于数秒后停止。光凝后1 d，7眼出现沿视盘两侧翼状有髓神经纤维的火焰状出血，视网膜动脉管径显著缩小，静脉管径变粗，形态迂曲，光凝点附近视网膜水肿。FFA显示视网膜下出血遮蔽荧光，动、静脉均无血流(图3)。5眼视网膜点片状出血，2眼仅有半侧静脉出现典型出血。光凝后3 d，大部分眼视网膜出血部分吸收，1眼玻璃体内残留少量积血。光凝后第7天，视网膜浅层出血仍有少量残留，玻璃体出血吸收，视网膜水肿渐消退。光凝后7～21 d，视网膜浅层出血吸收，双侧有髓神经纤维视网膜色淡；视网膜动、静脉血管管径变细，视网膜动、静脉均显示部分再通，但再通范围不同，形态变平直，伴随侧支血管形成。光凝后28 d，在再通的静脉中，有80%的血管充盈延迟；并在阻塞位点，观察到主要静脉周围的无灌注区。部分光凝处可见视网膜色素紊乱。

2.2 眼底组织病理学观察 2组光凝后1 d均出现不同程度的视网膜神经上皮层水肿，神经节细胞肿胀；光凝后28 d，2组视网膜层次清晰，但均出现视网膜神经节细胞核密度减少。并可观察到日本大耳白兔组视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)层缺乏色素颗粒，普通有色素组RPE层有较多色素颗粒(图4)。光凝后1 d，脉络膜血管切片可见白兔组脉络膜血管管腔被血栓填充，其主要成分为血小板、纤维蛋白、红细胞及少量炎性细胞，血管壁无明显损伤。有色素兔脉络膜血管切片未见血栓(图5)。

图3. 有色素组光凝后的典型视网膜表现 A为正常眼底；B为光凝后1 d，可见有髓神经纤维表面的视网膜火焰状出血，遮蔽荧光；C为光凝后7 d，出血逐渐吸收，血管开始再通；D为光凝后7～21 d，再通范围扩大；E为光凝后28 d，血管基本再通，再通血管较前变细，形态上发生变化，阻塞血管周围出现小范围的无灌注区

图4. 光凝后2组实验兔视网膜组织病理学检查(苏木精-伊红染色×400) A为白兔组光凝后第1天，RPE层(短箭头所示)缺乏色素颗粒，视网膜神经上皮层水肿，神经节细胞肿胀(长箭头所示)；B为有色素组光凝后第1天，RPE层(短箭头所示)可见明显的色素颗粒，也可观察到神经节细胞肿胀(长箭头所示)；C为白兔组光凝后第28天，视网膜各层结构清晰，视网膜神经节细胞核密度减少；D为有色素兔组光凝后第28天，神经节细胞核密度减少。视神经节细胞层(ganglion cell layer，GCL)；内丛状层(inner plexiform layer，IPL)；内核层(inner nuclear layer,INL)；外丛状层(outer plexiform layer，OPL)；外核层(outer nuclear layer，ONL)；外节状层(outer segment，OS)；视网膜色素细胞层(Retinal pigment epithelium，RPE)

图5. 光凝后1 d 2组实验兔脉络膜血管切片(苏木精-伊红染色×400) A为白兔组光凝后第1天，脉络膜血管内见新鲜血栓(箭头所示)，主要成分为红细胞、炎性细胞、血小板、纤维蛋白；B为有色素兔组光凝后第1天，脉络膜血管(箭头所示)未见血栓

3 讨论

光化学法制作的RVO模型与人类RVO的发病机制相似。最常用的是将孟加拉红(最大吸收波峰在550 nm处)作为光敏物质，激光照射欲阻断的视网膜血管，激发血液中的氧转变为氧自由基，启动内外凝血途径，形成视网膜血管内血栓。李闻思等[10]在2009年的一项关于兔眼底对光动力治疗反应研究中发现，色素的多少造成了眼底光化学反应部位的不同和程度差异。这种差异是否会在光化学法制作兔RVO模型中同样存在，又会对RVO病程有怎样的影响，成为我们设计本实验的初衷。本实验采用相同造模条件制作不同色素兔RVO模型，通过眼底彩照、FFA、组织病理学检查，比较不同色素兔光化学法诱导RVO模型的各自特点和差异。

通过对2组不同色素兔的观察，发现其各自特点和差异主要表现为：①白兔与有色素兔均可利用光化学法成功制作RVO模型。有色素兔中，疾病可以观察到3个阶段：第1阶段，术后即刻出现视网膜动、静脉血流停滞,术后24 h视网膜静脉完全阻塞，出血现象达到高峰；第2阶段，约于术后1～2周，视网膜出血、水肿逐渐吸收，血管再通，并且这种再通是从静脉主干向周边进行的，伴随侧支循环的形成；第3阶段，术后3～4周，血管基本再通，但血管管腔变细，走行与正常血管不同，并在血管周围存在小范围的无灌注区及色素紊乱。这点与以往的研究[6,11]结果一致。而白兔组，由于眼底不易观察，只能大致将其分为阻塞期、再通期，眼底分期无法像色素兔一样界定明显。②早期白兔视网膜水肿似乎比有色素兔更强，而出血却较有色素兔少。兔眼视网膜静脉接受光凝后产生视网膜动、静脉阻塞，此前已有报道[6,11]；而我们通过病理切片证实，白兔脉络膜中亦有血栓形成(图5)，有色素兔则未观察到此现象。这一点说明白兔眼底由于无色素组织的遮挡作用，脉络膜血管可直接吸收外界激光能量产生光化学反应，导致脉络膜血管阻塞；而有色素兔眼底由于色素组织的遮挡作用，可掩盖脉络膜组织的损伤。Iliaki等[7]将第二代光敏剂氯化铝磺酸肽菁注入无色素兔耳缘静脉，以二极管作为光源照射眼视网膜大血管的实验中，脉络膜阻塞长达7个月之久。而我们观察到1例白兔眼底脉络膜的脱离，这是否与其脉络膜的损伤较重关系密切，由于样本量小，我们尚不能给出确切的解释。此外2组视网膜病理切片都显示外层视网膜水肿(图4)，与以往研究[12-14]一致。③眼底彩照及FFA表现，二者截然不同。日本大耳白兔组眼底视盘境界显示不清，可同时透见视网膜血管及脉络膜血管网；FFA显像效果较差，视网膜血管显影较暗，视盘始终呈现为暗区，但血管阻断位点大致可辨，呈现相对强荧光。普通有色素兔组则表现为阻塞位点远端静脉扩大迂曲，沿大血管干的出血，遮蔽荧光，或者阻塞位点无荧光。这是由于白兔眼底缺乏色素，在强烈的脉络膜背景荧光的衬托下，视网膜血管的荧光反而显得相对较暗，我们发现，这点与人类白化病患者的眼底情况[15]相似。

兔眼的两侧视网膜静脉主干并不汇聚成一条中央静脉，而是两侧分别向下走行，动、静脉之间又存在广泛的动、静脉交通，并且在视网膜和脉络膜之间，存在一些毛细血管，这些都与人类不同[16]。这些解剖学差异使我们无法创造出与人类完全一致的CRVO模型。在光化学法制作兔RVO模型中，主要的造模原理是反应中产生的活性氧，特别是单态氧和自由基破坏血管内皮以及继发的血流淤滞和血管阻塞。视网膜色素含量并不是影响造模的关键因素。但比较国内外光化学法造模研究结果和本实验结果发现，不同色素含量的视网膜在接受光化学法造模后，实验结果存在一定程度的差异。尽管目前使用白兔造模是可行的，但由于其同时存在较为明显的脉络膜血管阻塞情况，且在眼底观察和眼底血管造影方面，有色素兔显示出显著的优越性，故我们认为在此模型中选用有色素兔将有利于对病程的掌握和观察。

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(本文编辑 诸静英)

Comparison of experimentally induced retinal vein occlusion between pigmented rabbits and conventional albino rabbits

QIAO-ZHUYi-fei，LIMing-xin.

DepartmentofOphthalmology，theAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege，Xuzhou221000，China

LI Ming-xin, Email：lmx216@vip.sina.com

Objective To compare the differences of experimentally induced retinal vein occlusion (RVO) between pigmented rabbits(PR)and conventional albino rabbits(CAR).Methods PR (n=10) and CAR (n=10) were included in the study. RVO was created by using an double-frequency laser(532 nm) following intravenous injection of Rose Bengal. A laser was applied to all major veins at the optic disc margin to mimic central RVO. Fundus photograph and fluorescence fundus angiography (FFA) were performed before photocoagulation and 15 min, 1 d, 3 d, 7 d, 14 d and 28 d after photocoagulation.Two rabbits was sacrificed in each group 1 d after photocoagulation for light microscopy observation, and the rest were killed 28 d after photocoagulation for light microscopy observation.Results Immediately following laser application, blood flow ceased or extremely slowed in the retinal veins in all cases. At 1 day after photocoagulation, CAR showed significant retinal edema and mild hemorrhages，while PR showed flame-shaped retinal hemorrhages; On FFA, no retinal blood flow was observed in most eyes (neither arteries nor veins) for both groups. Between week 1 and 3, reopening of laser sites and partial or complete revascularization of both retinal arteries and veins occurred; and most cases showed a progressive appearance of less hemorrhages and intraretinal edema. On week 4, there were small range capillary nonperfusion and pigmentary changes around the blood vessels which received photocoagulation before, however, the vascular pattern was abnormal. Histopathological examinations indicated that thrombus formed in choroidal vessels in CAR 1 d after photocoagulation, but PR didn′t show the same phenomenon. There was outer retinal edema 1 d after photocoagulation and retinal ganglion cell nucleus density decreased 28 d after photocoagulation in both groups.Conclusions RVO models were successfully established in both groups. Rose Bengal photochemical method on ocular fundus of different pigmented rabbits have different photosensitive reaction and histological damages. On Fundus photograph and FFA, the imaging of CAR is significant different from that of PR. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2014,14:172-176)

Photochemistry； Retinal vein occlusion； Pigment

徐州医学院附属医院眼科 徐州 221000

李明新(Email:lmx216@vip.sina.com)

2014-02-17)