Epiplakin及其研究进展

张 伟(综述)，王文氢(审校)

(河北医科大学第四医院皮肤科，石家庄 050011)

1992年，Fujiwara等[1]描述了一个临床和病理组织学改变类似大疱性类天疱疮的表皮下水疱病患者。免疫印迹分析显示患者血清没有与BPAG1和BP180反应，而是识别了一个相对分子质量为45×104的表皮多肽，这个表皮多肽在人类角质形成细胞和一些像HeLa、KB、A431系的转化细胞系中表达[2]。经研究，该抗原是plakin家族的成员,由于来源于表皮,故命名为Epiplakin(EPPK)，其独特的分子结构使EPPK具有区别于其他家族成员的特征。

1 EPPK的组织定位

EPPK分布广泛，EPPK在单层上皮及复层上皮都有定位。EPPK主要分布在肝脏、小肠、结肠、腮腺、肾、阑尾中，在胎盘、肺、脑、脊髓中分布较少[3]。最近研究发现，在头发[4]、成年鼠视网膜神经节细胞、双极细胞和马勒神经胶质细胞、鼠胚胎视网膜、nestin阳性神经祖细胞[5]及胚胎早期及成年期胰腺、胰腺祖细胞和胚胎分化细胞[6]中也有EPPK表达。

2 EPPK的基因结构及分子结构

EPPK分子在人类和鼠类组织中均有表达，但种属不同，其基因结构及分子结构也不完全相同，有各自的特点。

2.1人类EPPK的基因结构及分子结构 编码人类EPPK的EPPK基因(EPPK1)是一个plakin家族基因，位于人类染色体8q24.3。根据2003年4月的UCSC人类基因浏览器(http://genome.ucsc.edu)，EPPK1长度为7524 bp。

EPPK1有独特的结构：仅有1个15 195 kb的外显子，包含13个亚单元，编码13个核苷酸序列高度同源的plakin重复结构域(PRDs)，最后5个亚单位几乎是完全相同的；研究发现在EPPK基因3′末端的5个同源重复结构域的连接区部分含有三核苷酸(GCC)n的重复序列，它们编码聚丙氨酸。为了研究该分子的多态性，Takeo等[7]分离了15个健康人的DNA，运用套式聚合酶链反应扩增EPPK 3′末端的5个同源重复结构域的第一个，结果显示正常人(GCC)n重复分布具有多态性，在5～9最多见的重复数为8，15条染色体中有5条是在第5个重复的GCC中有从G到A转录。说明这些个体微卫星区域存在多样性。

人类EPPK的分子结构与同属于plakin家族成员的桥粒蛋白不尽相同。几乎所有的plakin家族成员分子结构都有一个共性：有一个球状N端，C端的结构域被一个中央杆状结构域隔开。桥粒蛋白是由球状N端、中央螺旋杆样结构域和C端的3个同源PRDs，A、B、C结构域和富含甘氨酸-丝氨酸-精氨酸结构区构成。PRDs是由38个氨基酸中4.5个副本构成，桥粒蛋白B和C亚结构分析显示独特折叠球状结构[8]。

人类EPPK分子重要的特征是具有13个PRDs，13个PRDs与首次在桥粒蛋白C端发现的B结构域更相似，B结构域可以分为两部分：一部分约70%是桥粒蛋白B结构域(3、6、8和13结构域)；另一部分45%～50%是桥粒蛋白B结构域(1、2、4、5和7结构域)。而且，9和13结构域及这5个结构域之后的连接区几乎完全相同。在EPPK分子中没有发现螺旋杆样结构域和N端结构域，序列中没有发现二聚体，表明EPPK在活体中可能以单链结构存在[3]。

2.2鼠类EPPK的基因结构及分子结构 鼠类EPPK1位于鼠第15号染色体的中间区域，分析显示鼠的EPPK1包含一个不编码的外显子1、一个大的(-20 kb)编码外显子2及一个内含子。

鼠EPPK分子结构与人类EPPK不同，C端可识别的几乎完全相同重复结构数目有8个。人和鼠EPPK分子B结构域的相似度比连接区的相似度更明显，如人类和鼠类对应的第9个B结构域的氨基酸序列大约90%相同，而对应的连接区的氨基酸序列大约63%相同。与人EPPK分子B结构域相似，鼠的B结构域中，Ⅰ组与网蛋白第1个B结构域相比有约70%完全相同(3、6和8～16结构域)：Ⅱ组与网蛋白第1个B结构域相比有约50%或更少的相同程度(1、2、4、5和7结构域)[8-9]。

虽然人类和鼠类EPPK的B结构域高度同源，但两种属的连接区相对不同。连接区中的三核苷酸(GCC)n的重复序列仅位于人类EPPK1，因此微卫星长度异常导致的遗传性皮肤病和核苷酸重复区域异常导致的中枢神经系统疾病仅限于人类[7]。

3 EPPK的功能

大多数plakin都是大分子，有特定的结构域，例如肌动蛋白结合结构域、螺旋状螺旋杆结构域和PRDs。这些结构域通过与细胞骨骼相互作用锚定在膜结合复合体上维持组织的完整性[10]。同其他plakin家族成员一样，EPPK是个大分子，然而，EPPK缺少中间部分的螺旋杆样结构域及N端球状结构域[3]。在活体中，EPPK独特的重复结构域毫无疑问会影响到其分子功能[11]。

3.1人类EPPK与中间丝 Jang等[12]运用免疫染色、叠加分析和RNAi剔除法研究人类EPPK的作用时发现，重复单元(PRD+连接区)与角蛋白的结合力很强，也观察到与波形蛋白的结合，只是作用较弱。EPPK基因剔除显示单层上皮中间丝(intermediate filaments，IF)网状结构的崩解。拯救实验表明重复单元阻止了IF网状结构的崩解，推测EPPK在单层上皮细胞中参与维持IF网状结构的完整性。为进一步检测EPPK与IF的结合能力，Wang等[13]利用包含有EPPK的一个结构单元及亚结构单元的融合蛋白行狭缝印迹(slot-blot)分析，结果显示B结构域结合角蛋白至少需要4.6个拷贝中的2个。增加EPPK连接区内的重复结构的数目，EPPK与IF的结合力也会增强。在此研究中也检测到EPPK与波形蛋白和肌间线蛋白有相似的结合，只是结合力较弱。实验结果表明，EPPK的B和连接区结构域与中间丝间存在相互作用，EPPK的B和连接区结构域中的高度重复结构在分子的功能中起到了至关重要的作用。

3.2鼠类EPPK与中间丝

3.2.1正常情况下鼠类EPPK与中间丝 为了进一步研究EPPK的功能，Goto等[11]和Spazierer等[14]分别作出了EPPK基因剔除鼠(EPPK-/-鼠)。EPPK-/-鼠与野生鼠表现型无明显差异：发育正常，表皮及毛发正常，有生育能力。Spazierer等[14]研究发现尽管EPPK在复层及单层上皮大量并高特异性表达，但鼠EPPK缺失未导致严重的皮肤功能障碍。Spazierer等[15]运用体外结合分析发现，几乎所有鼠的EPPK的16PRDs与基底角质形成细胞的角蛋白结合。然而，在角质形成细胞初代培养中发现EPPK仅与部分IF网状构造共存。通过角蛋白过度磷酸化、渗透性休克或紫外线照射方式给予细胞应力，整个胞质EPPK均与角蛋白结合。Time-course实验显示，丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸磷酸酶抑制物诱导的IF崩解速度在EPPK缺乏的分化角质形成细胞中的比野生鼠快。作者认为在应力存在的条件下EPPK对IF重建起到了重要作用，可能通过伴侣蛋白的方式抗崩解来保护IF[15]。

3.2.2创伤情况下鼠类EPPK与角蛋白 Goto等[11]发现EPPK-/-鼠背部创伤愈合速度较野生鼠和杂交鼠快。对EPPK剔除和EPPK过度表达的HeLa细胞的研究也发现EPPK剔除HeLa细胞的移动速度显著增高，而EPPK过度表达的HeLa细胞的移动速度明显被抑制[16]。野生鼠伤口边缘，在增殖的角质形成细胞中表达的EPPK与K6连接。在EPPK-/-鼠中未发现类似的增殖角质形成细胞，但是迁移的角质形成细胞微弱地表达K6。在野生鼠外植体培养的一些角质形成细胞中EPPK与K6共表达，提示EPPK可能与K6存在功能上的联系。

Ishikawa等[17]进一步研究野生鼠和EPPK-/-鼠在无创伤和有创伤情况下EPPK与角蛋白的关系，发现在无创伤的表皮中，与其他蛋白相比，EPPK更多地与角蛋白17(K17)共存。创伤后，EPPK-/-鼠和野生鼠中K5、K10、K6和K17的表达相同，但EPPK-/-鼠角质形成细胞中角蛋白丝更细。创伤野生鼠的免疫染色电镜显示EPPK与K5、K10和K6共存。提示在创伤愈合过程中，增殖的角质形成细胞EPPK加速角蛋白成束。

3.3EPPK的标记作用 EPPK1不仅在皮肤组织表达，在其他组织也检测到了EPPK1。Yoshida等[5]在成年鼠视网膜中检测到EPPK1 mRNA和蛋白，在胚胎视网膜nestin阳性细胞、成年鼠中视网膜神经节细胞、双极细胞和马勒神经胶质细胞中都有EPPK1表达，表明EPPK1与视网膜的发育有关。Yoshida等[6]在胚胎期胰腺上皮中发现了EPPK1+/Pdx1+和EPPK1+/Sox9+胰腺祖细胞。此后，EPPK1的表达局限在Ngx3+或Sox9+分泌祖细胞和p48+外分泌祖细胞中，在出生时EPPK表达局限在导管细胞和α细胞以及成年鼠胰腺中央腺管细胞和导管细胞中。先前被认为是胰腺导管腺癌前期损伤的胰腺上皮内瘤中检测到了EPPK1。另外，因蛙皮素引起的急性胰腺炎(一种acinar细胞再生模型)，EPPK1阳性细胞也增多。EPPK1对检测发育和重生胰腺的胰腺祖细胞来说是一种有用的标志物[6]。

Matsuo等[18]研究鼠发育和再生的肝脏时发现EPPK1在初期的双向分化潜能的肝母细胞表达，以后限于在胆管细胞表达。出生后，EPPK1在胆管表达。在含乙硫氨酸无胆碱饲养的鼠肝脏中，EPPK1阳性细胞数量显著增加并表达A6，表明此细胞为肝脏祖细胞。某些EPPK1阳性细胞表达一种增殖标志物增殖细胞核抗原，证明这些细胞是短暂的增殖细胞。所以，EPPK1可以作为探测发育中及成年肝脏中祖细胞的标志物。

3.4其他 Steiner等[4]研究鼠毛囊内毛根鞘交叉连接的蛋白，发现毛透明蛋白与EPPK交叉连接在毛囊的内毛根鞘细胞角化膜中，扮演了交叉桥架增强蛋白的角色。Fabre等[19]试图识别腹泻综合征的致病基因，运用直接序列测定或结合分析，最终排除了EPPK1。Blagoev等[20]研究表皮生长因子受体通路时检测到信号分子EPPK与表皮生长因子受体-Src同源胶原蛋白特异性结合形成复合物。

4 结 语

截止目前，EPPK在人类及鼠类中的基因和分子结构已全部探明，并证实了人类EPPK分子具有个体多态性，EPPK基因剔除鼠模型已制成，EPPK在创伤修复过程中，在机械外力下维持细胞完整性的作用正在进一步研究中。随着对EPPK的深入研究，其与微卫星异常长度导致的遗传性皮肤病和核苷酸重复区域异常导致的中枢神经系统疾病的关系，EPPK分子在广泛分布的各种组织中的重大作用将会被逐渐发现。

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