RNA干扰技术及其在神经病学中的研究进展

敖媛媛，孙洪英，杨国安(综述)，和姬苓※(审校)

(内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院 1神经内科， 2中心实验室，内蒙古 包头 014010)

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象[1],这项技术为生命科学带来了重大的革新，其迅速从实验室技术走向对哺乳动物的遗传学研究中,并且在哺乳动物中调节RNAi的小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)在被发现后迅速用于开发治疗人体疾病药物[2]。在神经病学的领域，RNAi不仅仅作为一种研究工具，其在机体中可影响中枢神经系统的正常发育，其功能异常可导致某些神经系统疾病的发生(如脆性X智力低下)[3]，在正常生理功能中RNAi亦有具有重要的功能,如维持正常的基因表达,染色体结构和抗病毒功能[4]。在试验研究中通过RNAi沉默特定基因，可用于研究神经系统疾病的发病机制、开发目前无良好治疗方法的神经系统疾病药物。

1 RNAi的过程

在以往的研究中发现植物中某些转录后的基因具有沉默其他通路的作用，随后Wood等[5]发现“正义RNA”抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量双链RNA(dsRNA)而引发，并将这一现象命名为RNAi[6]。内源性的双链RNA分子经过细胞核酸内切酶Drosha的修饰[7]，随后转运到细胞质中，再次经过核酸内切酶Dicer的修饰形成21～23个核苷酸长度的双链RNA。这些双链RNA可以和RNAi特异性结合，并且根据它们的功能和来源被分为两类：siRNA和微RNA(mcroRNA，miRNA)[8]。在细胞质中，“反义”或“正义”的双链嵌入一个被称为RISC(RNA induced silencing complex)蛋白复合体，并和序列互补的RNA相结合导致其靶标RNA的降解或者翻译抑制[9]。

通过研究探明RNAi在中枢神经系统功能中发挥作用，有助于阐明RNAi在正常的脑功能及神经系统疾病中扮演的作用，并有助于推动RNAi治疗在临床神经科学中的应用。初步的研究表明，miRNA在哺乳动物大脑的不同区域发挥着不同的作用，并且RNAi在大脑的发育过程中具有重要的作用[10]。在非神经元细胞中加入大脑中特异的miRNA后，可促使该非神经元细胞表达的蛋白类型转向神经元细胞的表达蛋白类型，miRNA具有调控多种目的基因表达的功能，miRNA在中枢神经系统和身体其他部位能增强RNAi调控的作用[11]。通过生物信息学实验预测，在人类基因组中有1/3的基因可以通过RNAi途径调节[12]。

在人类神经系统疾病研究中发现，大脑中RNAi亦发挥了重要的作用，X染色体易损综合征是由脆性X智力障碍蛋白(fragile X mental retardation protein,FMRP)基因突变引起的遗传性智力低下，正常FMRP可以调控突触的可塑性，而神经元中FMRP的表达由RNAi调控，RNAi的异常即可导致FMRP的表达异常[13]。可见，RNAi途径的异常可能是导致神经性疾病发病机制的基础。

2 开发具有治疗潜力的RNAi

在临床中开发能够有效治疗中枢神经系统疾病的药物仍然是一个难题。中枢神经系统是人体中最特别的器官，在中枢神经系统内大量神经细胞聚集在一起，有机地构成网络或回路[14]。由于神经元无法进行有丝分裂，一旦受到损害就很难恢复正常[15]。临床神经科学的一个重要研究目标就是如何有效地改善和治疗神经变性疾病中产生的神经损伤，而目前RNAi被认为具有开发成该类药物的重大潜力。

在许多神经变性疾病中，导致神经功能障碍或细胞损伤的生物学基础目前尚未得到完整、透彻的研究，但是对于发病相关的基因及相关基因产物的研究目前已经相对成熟，在这些疾病中表达有缺陷的蛋白对神经元细胞产生毒性，而沉默致病基因可有效预防有毒蛋白的积累是一种有效的治疗手段[16]。目前，脑神经变性疾病治疗性RNAi的研究已取得一定成功，但其应用到临床前仍需进一步地深入研究，目前在非神经疾病领域(如病毒性肝炎和癌症)治疗性RNAi的研究也在逐步开展[17]。

在治疗性RNAi的设计中，治疗性RNAi必须能够特异性靶向沉默变异蛋白而不影响机体正常蛋白的表达。特别是在由遗传变异导致的毒性或者负显性作用蛋白表达的疾病中。考虑到靶点蛋白的正常生理功能，如果靶标基因不是一个必需基因，目标基因和等位基因均可采用非特异性靶标结合；但如果同时沉默两种等位基因是有害的，则必须保护野生型基因的正常表达，例如亨廷顿舞蹈病。在疾病中功能或者必需蛋白尚未研究清楚时(如原发性肌张力障碍是由于DYT1基因突变所导致的疾病)最合适的方式是寻找突变等位基因的特异性靶点，这样才能同时保证野生型基因的正常表达，维持机体的正常状态和生理机制[18]。目前，等位基因特异性沉默已经在多种疾病中证实具有可行性。

3 靶标特异的神经系统疾病

3.1等位基因特异性沉默 DYT1是最常见的遗传肌张力障碍，虽然DYT1的发病机制尚不明确，但多种研究表明RNAi治疗适用于DYT1：①DYT1中的突变蛋白torsinA由于负显性表达而产生神经毒性[19]。②所有类型DYT1都是由于DYT1基因中GAG碱基缺失导致的[20]。③DYT1肌张力障碍中神经元退变在病理、生理学上是可逆的[21]。在细胞培养实验中，野生型和突变基因之间的三个核苷酸差异已经允许使用siRNA等位基因特异性沉默突变基因。

当野生型和突变等位基因仅仅相差一个核酸时，siRNA可以通过单核苷酸序列的不同进行区分，例如在额颞叶痴呆中tau的突变[22]。家族性肌萎缩性脊髓侧索硬化症是由于一个乙酰胆碱受体亚单位突变所导致的先天肌无力，导致其中超氧化物歧化酶基因突变的等位基因目前已经可以识别[23]。但不同于DYT1肌张力障碍,所有这些疾病中基因突变均为非均质性的，这要求针对不同的突变设计不同的siRNA。

3.2针对偶发性疾病 非遗传性神经系统疾病比基因突变所导致的疾病更为常见，如阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)和偏头痛等。AD是最常见的神经退行性疾病，AD进行siRNA干预治疗的研究也进行的最为深入，对于AD发病机制的研究表明β淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)家族在AD的发病中具有至关重要的作用[24]。研究者尝试采取不同的RNAi方法对其进行治疗，如直接沉默Aβ的前体-淀粉样前体蛋白的表达[25]；沉默Aβ生成所需的两种蛋白酶之一β分泌酶；或沉默AD神经元的神经纤维缠结的tau蛋白的表达，这些推测需进一步在实验动物模型上进行证实。

RNAi是否能够有效的沉默靶基因并不是唯一需要考虑的问题，当准备把RNAi推广使用到人体上时仍然有许多问题需要面对，例如何时开始进行治疗、靶基因是进行持续沉默还是间歇沉默、治疗维持多长时间。这些问题对于RNAi的推广使用均具有非常重要的作用。此外，RNAi的安全性值得进一步考虑，其是否会伤害到人体的神经元细胞仍值得商榷。

4 体内RNAi治疗研究

体外研究成功证实了RNAi对于神经性病变的治疗作用，而进一步的实验需在动物体内开展。通过在转基因小鼠模型上进行研究收集实验数据，为将RNAi应用于人类治疗提供理论基础。但是，RNAi药物是否能够有效进入中枢神经系统是一个巨大的问题，单纯口服或静脉注射无修饰的RNAi均无法取得良好的效果，因为短链核酸无法通过血脑屏障到达靶标神经元细胞，直接注射无修饰RNAi进入脑实质亦未取得良好的治疗效果，但有报道称通过注射高浓度RNAi进入室性脑脊液取得了成功[26]。但目前大部分研究均认为单纯的未经修饰的RNAi不适合作为治疗药物[27]。目前有研究报道称，为RNAi连接上载体分子可促进药物的吸收，Gitlin等[28]研究显示在RNAi上连接上胆固醇灌胃给药可以促进药物在小鼠上的肝靶向性和肠道靶向性，据此可推测在RNAi上连接胆固醇或者其他脂质通过脑室灌注可有效促进药物扩散到神经细胞，另一项研究显示RNAi上连接细胞穿膜肽可有效促进药物和神经细胞结合。这些研究都证实，选择合理的载体可以促进RNAi在机体中的吸收[29]。

有研究报道，RNAi不适用于慢性神经系统疾病，大多数神经变性疾病需要长期的沉默致病基因，而RNAi在单次给药后，沉默效果无法维持足够长的时间[30]。有研究报道，通过系统编码短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)可以延长RNAi的时效，shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一个茎环(loop)序列分隔，组成发夹结构，由pol Ⅲ启动子控制；随后再连上5～6个胸腺嘧啶作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子,在活体中输送siRNA的一种办法是将siRNA序列作为“短发夹”克隆进质粒载体中[31]。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个“双链RNA”(dsRNA)，并被RNAi通道处理，shRNA可以通过血脑屏障并到达预定的靶标神经细胞，这项实验技术已经在啮齿类动物脑癌的治疗中得到确证。

通过脑实质内注射以病毒为载体的shRNA，该方法以病毒载体传递shRNA至中枢神经系统。Davidson等[32]在绿色荧光蛋白转基因小鼠上证实了该方法，在小鼠纹状体注射shRNA表达的腺病毒后可以观察到显著的沉默转基因。随后的研究显示，在啮齿动物中脑注射shRNA表达的腺病毒(adeno-associated virus，AAV)可以表现出长期的抑制内源性酪氨酸羟化酶活性的作用[33]。Davidson等[34]研究显示，以AAV为基础的shRNA可以部分抑制小鼠脊髓小脑的共济失调1型临床、病理学和细胞学症状。在小鼠亨廷顿氏舞蹈病模型中采用AAV和猫免疫缺陷病毒为基础的shRNA传递系统取得类似的结果。两个最新的报道显示，shRNA表达的慢病毒能够进入家族性肌萎缩性脊髓侧索硬化症小鼠模型脊髓前角运动神经元，改善它们的行为和病理学变化，提高模型小鼠的存活率[35-36]。这些研究通过建立以病毒为载体的shRNA传递体，以获得RNAi在中枢神经系统的长期治疗。目前的研究重点在于病毒载体能够通过灵长类的血脑屏障，并且在脑内达到足够的治疗浓度。

5 结 语

RNAi在神经系统功能中具有重要的作用，RNAi调控技术目前已成为一个非常重要的实验技术，并且为许多无法治愈的神经系统疾病提供了其他的治疗选择。随着对RNAi机制进一步地深入了解，以RNAi为基础的药物将会具有更大的应用前景。但是，目前的研究多为在实验室水平考察RNAi对多种神经性疾病小鼠模型的治疗作用，虽然取得了良好的治疗效果，但其仍需要在进一步临床前研究考察治疗性RNAi的有效性和安全性。通过对RNAi在神经病领域的积极研发，RNAi技术定能逐步运用于神经变性疾病的临床治疗中。

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