肺动脉高压相关因子的研究进展

王 鹏(综述)，赵延恕(审校)

(中南大学湘雅二医院心内科，长沙 410011)

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一类复杂的累及肺血管系统的病理生理综合征。目前PAH定义为：海平面、静息状态下，右心导管检查测定平均肺动脉压>25 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，或运动状态下时平均肺动脉压>30 mm Hg，且肺毛细血管契压或左心室舒张末压<15 mm Hg，肺血管阻力>3Wood单位。组织病理学定义：PAH是指血管收缩、细胞增殖、体内血栓形成，以及血管壁重构[1]。PAH诊断相对困难，处理极为棘手，致死率和致残率高，严重影响着患者的生活质量，但其发病机制至今尚未完全阐明。近年来研究认为，PAH的主要病理变化是肺血管内皮细胞损伤、增生和功能障碍致使肺血管的结构重建，其中许多因子参与了此过程[2]。下面就近年来研究较多且热门的因子予以概述。

1 调宁蛋白

调宁蛋白(calponin)为一种平滑肌所特有的调控蛋白，最初是从鸡的胃中分离出来[3]，随组织和种属不同而有些变化。钙调节蛋白按其等电点(isoelectric point，pI)的大小可分为三种异构体：碱性调宁蛋白(h1 calponin，h1 CaP，pI 8～10)大多表达于终末分化和非增殖性的平滑肌细胞；中性调宁蛋白(h2 calponin，h2 CaP，pI 7～8)主要分布于心肌组织和人的角化细胞；酸性调宁蛋白(h3 calponin，h3 CaP，pI 5～6)无组织表达特异性。其中h1 CaP在调节平滑肌收缩、抑制细胞增生、参与细胞信号转导和维持细胞骨架等方面具有重要作用，因此一直是研究的重点。h1 CaP在内皮细胞内合成，相对分子质量为34×103，其染色体定位于19p13.2，为细肌丝结合蛋白，能够抑制ATP酶的活性，在去磷酸化时此作用增强，磷酸化时此抑制作用被逆转。它与肺血管重构的关系如下。

1.1抑制细胞增生 有研究发现，h1 CaP在增殖细胞中有明显下调作用[4]。h1 CaP是一种抗细胞增殖基因，当生长停止的细胞重新进入细胞周期的G1期和增殖时h1 CaP的基因表达会下调。曹禹等[5]实验证明与正常小鼠相比，PAH组小鼠平滑肌细胞中h1 CaP含量较对照组显著降低。在骨折愈合中，h1 CaP基因剔除的小鼠依靠活化的骨膜成骨细胞的大量增生使得新骨形成增加[6]。在平滑肌肉瘤中(一种子宫平滑肌新生物)，h1 CaP表达减少，而将h1 CaP转染人类平滑肌肉瘤细胞系，会发现它可以抑制肿瘤细胞增殖[7]。

1.2参与细胞骨架的维持 h1 CaP可通过与中间丝、微丝、微管蛋白及磷脂结合来稳定细胞骨架系统。h1 CaP不仅能与F-肌动蛋白结合，从而抑制肌动蛋白对ATP酶的活化，还能有规律地与原肌球蛋白结合，且与肌动蛋白的结合不受肌球蛋白影响。另外，h1 CaP还存在钙调蛋白结构域，两者的结合呈钙依赖性，一旦两者结合，h1 CaP对ATP酶的抑制作用可被逆转[8]。在体外，h1 CaP结合磷脂，特别是带负电荷的磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇[9]，连接不同类型细胞的质膜。当细胞受激动剂刺激时，h1 CaP从细胞骨架向质膜易位[10]。Takeoka等[3]研究发现，h1 CaP可以通过影响细胞骨架的活动抑制人纤维肉瘤HT 1080细胞的生长。

1.3参与细胞信号转导 h1 CaP具有多个信号分子蛋白的结合域，除了结合肌动蛋白外，它可能还作为受体蛋白，与细胞外信号调节激酶、蛋白激酶C等很多蛋白配体结合，并且通过其磷酸化来调节激酶的活性，激活收缩诱导的信号转导通路[10-11]。这些信号转导通路与各种调节平滑肌收缩、胞质分裂、细胞分化和增殖的物质之间均存在着广泛的联系，h1 CaP可能就在其中发挥着重要的作用。

但h1 CaP在肺动脉平滑肌中的具体作用和作用机制尚需进一步探讨及研究证明。利用h1 CaP进行早期干预，能否预防PAH和肺血管重构的发生，以及如何延缓其进展，也需进一步探讨。

2 FHL-1

FHL(four and a half Lin-Isl-Mec domain)家族共有5个成员，即FHL-1、FHL-2、FHL-3、FHL-4、FHL-5/ACT(activator of CREM in testis)，该家族蛋白结构中含有四个半Lin-Isl-Mec(LIM)结构域，属于LIM超家族。LIM结构域最早是在分离鉴定线虫Lin-1基因、大鼠Isl-1基因和线虫Mec-1基因编码产物时发现的，LIM 是3种转录因子Lin-11、Isl-1和Mec-3的缩写。FHL家族蛋白在胚胎发育、细胞分化、肿瘤发生发展及细胞骨架形成中起重要作用[12-14]。FHL家族在不同组织中表达具有特异性。FHL-1是FHL家族中表达最广泛的成员，在骨骼肌中表达最丰富。FHL-1的LIM蛋白域是1个富含半胱氨酸的锌指蛋白结构域[15]，可以介导蛋白质间的相互作用和转录因子、信号通路蛋白及细胞骨架蛋白间的相互作用。最近有研究表明，FHL-1高表达与肌细胞增生、肥大密切相关，推测其可能参与了肺血管重构[16-18]。Kwapiszewska等[19]用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测低氧诱导的PAH小鼠模型肺组织中各种蛋白质的表达情况，发现FHL-1随肺动脉平滑肌细胞增生而表达不断增加，进一步使用免疫印迹、免疫组织化学、RNA转染等试验也都证实肺动脉平滑肌细胞中的FHL-1表达上调；并且FHL-1的表达具有特异性，仅在肺循环系统可观测到其表达上调，而在体循环系统未见上述变化，这正与低氧导致肺循环阻力增加而体循环阻力降低的效应相符。因此，FHL-1可能是PAH发生、发展及肺血管重构过程中一种发挥重要作用的蛋白，是一种调节各种PAH形成的新蛋白。

3 血管内皮生子因子

血管内皮生子因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，又称血管通透因子，具有促进血管渗透及诱导血管生成的作用，是Leung等[20]于1989年在牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中首先纯化出来的蛋白质。纯化后的VEGF表现为一种具有肝素结合活性的同源二聚体多肽，每条单链含16个半胱氨酸，相对分子质量为(34～42)×103，根据VEGF mRNA的不同剪切方式，VEGF有五种分子变异，即VEGF-A，-B，-C，-D和血小板生长因子。VEGF存在两类结合位点：受体结合位点与肝素结合位点。VEGF以旁分泌和自分泌方式，通过三种具有酪氨酸激酶活性的受体Flt-1、Flk-1/KDR(kinase insert domain receptor)和Flt-4，特异性地作用于靶细胞-血管内皮细胞而发挥生物学作用[21]。已有实验证实，PAH的小鼠模型中，肺内VEGF表达增加。而VEGF的增加可能通过旁分泌方式作用于肺小动脉内膜，进而引起动脉壁平滑肌增生肥厚、内皮细胞增生或纤维化以及介导新生血管的形成，由此产生明显的肺血管重建[22]。随着病情的发展，血管中膜和内膜增厚、细胞外基质增多、血管弹性下降，血管狭窄或闭塞，肺细小动脉肌化，最终导致低氧性PAH的形成[23]。缺氧又可以诱导VEGF的转录，增强VEGF mRNA的稳定性，防止降解，从而间接提高VEGF的生理活性，由此形成恶性循环。还有研究表明，VEGF能通过促进内皮细胞合成和释放内皮性舒张因子一氧化氮(nitric oxide，NO)来对抗内皮素的作用，增加妊娠期胎羊的肺血流量，降低肺血管阻力，促进NO释放机制可能是通过激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K)来实现的，因这一作用可被NO受体阻滞剂和选择性PI3K阻滞剂所阻断，所以NO可被视为发挥血管活性的下游因子[24]。VEGF是目前知道的最强的血管生长因子，它是内皮细胞的特异性有丝分裂原，也是一种有效的血管形成和血管通透性诱导因子，它通过与血管内皮细胞表面的特异性受体结合，使受体自身磷酸化，激发细胞内信号转导，促进内皮细胞进行有丝分裂，提高血管通透性，致使基膜溶解，成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞迁移，从而促进新血管形成。因而，VEGF在肺血管重构过程中具有重要作用。

4 骨形成蛋白Ⅱ型受体

人骨形成蛋白Ⅱ型受体(bone morphogenetic protein receptor type Ⅱ，BMPR2)基因全长约190 kb，位于染色体2q33，由13个外显子和12个内含子组成，其cDNA长约4 kb。BMPR2基因属于转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)受体超家族成员，编码一个跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体，其外显子1～3编码细胞膜外配体结合区，外显子4编码跨膜结构区，外显子5～11编码细胞内丝氨酸/苏氨酸激酶结构区，外显子12、13编码细胞质尾部区[25]，其配体为骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)。TGF-β信号转导途径包括BMPR2、BMPR1、BMP和受体底物Smads等。研究表明，BMPR2信号转导通路抑制平滑肌细胞及内皮细胞的增殖与迁移,并促进平滑肌细胞表型的分化[26]。目前认为，BMPR2基因突变引起其功能缺陷是家族性PAH的重要发病机制。在欧美国家，50%的家族性PAH患者和26%的特发性PAH患者都存在BMPR2基因的突变[27-28]。另外发现在先天性心脏病合并PAH和服用减肥药所致的PAH患者中，有一部分存在BMPR2基因的异常[29]。研究表明约1/3的家族性PAH和特发性PAH患者存在TGF-β/BMPR/Smads信号转导通路缺陷，导致肺血管内皮细胞及平滑肌细胞增生异常及肺血管重构，是PAH发病的重要原因[30]。此外，由于BMPR2基因突变表达出不成熟或无功能的BMPR2蛋白，使BMPR2激酶活性丧失而阻断下游的信号通路，导致肺血管内皮细胞微循环障碍和反应性动脉重构[31]。肺动脉平滑肌细胞BMPR2基因剔除的小鼠可出现BMPR2/BMP/Smads信号转导异常，失去抑制平滑肌细胞生长的功能，从而导致肺血管平滑肌细胞增生肥厚及肺血管异常重构[32]。人类BMPR2主要表达于肺血管内皮细胞，而较少表达于平滑肌细胞，因此肺血管内皮细胞可能成为PAH治疗的重要靶点。

5 Notch3

Notch家族是由一组高度保守的蛋白质组成，它们具有受体和调节基因转录的功能，可通过细胞内蛋白质之间的相互作用或细胞间信息传递而实现信号的调控。Notch信号途径包括Notch受体、配体及其相应的细胞内信号分子。在脊椎动物中共发现了4种Notch蛋白的同源体：Notch1(Tan-1)、Notch2、Notch3和Notch4(Int-3)。Notch受体蛋白是一个约3×105的单链跨膜蛋白，包括胞外区、跨膜区和胞内区三部分，其中胞外区和胞内区均为高度保守区域。Notch信号途径通过局部细胞间相互作用，实现细胞间通讯、胞质内的信号转导以及核内转录，从而控制细胞的增殖、分化、凋亡、迁移及黏附等，在机体的整个生长发育过程的调控中发挥着重要的作用。乔莉娜等[33]实验发现，肺切除联合野百合碱诱导的PAH大鼠的肺动脉平滑肌细胞内Notch3 mRNA的表达明显升高。随后Li等[34]的进一步研究表明，低氧诱导的小鼠及野百合碱诱导的大鼠PAH模型中肺动脉平滑肌细胞内Notch3基因及蛋白表达增加；在人类非家族性PAH患者中Notch3基因及蛋白表达也明显增加，且病情的严重程度与肺内Notch3表达量具有正相关性；通过对基因剔除Notch3的小鼠模型研究后发现，缺失Notch3的小鼠在低氧条件下不会产生PAH；使用分泌素抑制剂阻断Notch3信号，可逆转小鼠PAH。这些研究都说明Notch3信号与PAH的发生关系密切，Notch3信号途径极有可能成为PAH治疗的新靶点。

6 结 语

PAH是各种心肺疾病最常见且严重的合并症之一，发病机制极为复杂，许多环节仍然不明确，且其临床治疗效果欠佳，探讨其发病机制，控制和延缓PAH的发生、发展对治疗疾病非常必要。目前，无论从细胞、分子水平还是从遗传学角度，PAH发病机制的研究都取得了很大进步，近年来，对PAH形成机制以及各种因子的认识已经积极应用于临床中，并取得了切实的疗效。但仍需要继续大量的研究，为临床治疗提供更有价值的信息，相信在不远的将来，新的手段不断被发现，PAH的治疗将步入一个崭新的时代。

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