高原低氧适应与EPAS1/HIF-2α及EGLN1/PHD2的相关性

李雪冰(综述)，李福祥，肖贞良(审校)

(1.泸州医学院呼吸内科，四川 泸州 646000； 2.成都军区总医院重症医学科，成都 610083；3.成都军区总医院呼吸内科，成都 610083)

大气氧分压随着海拔升高而降低，在高原地区学习工作生活的人们必将面对高原低氧环境所带来的种种不适。当机体无法完全适应时就可能导致急、慢性高原病的发生。并非所有居住于高原的人都将发生高原病。喜马拉雅山脉的藏族人、安第斯高原的安第斯人已世居高原数千年，形成了各自的可继承低氧抵抗策略。藏族作为高原低氧适应的代表，被公认为能更好的适应高海拔环境。藏族人群表现出较高的一氧化氮水平，较大的静息状态下通气量和较强的低氧通气反应，较高的出生体质量，以及与海平面居住人群相近的血红蛋白浓度，反映出其对高原环境独特的适应性[1-3]。为了揭示潜藏于这种生命现象的遗传基础，各国科研工作者展开了对低氧信号相关通路基因的系列研究。作为当前最热门的高原低氧适应的自然选择候选基因EPAS1(endothelial PAS domain protein 1)/低氧诱导因子2α(hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α)和EGLN1/PHD2(egl-9 family hypoxia-inducible factor 1)成为了研究热点[4]。

1 EPAS1/HIF-2α基因相关研究

高原反应的本质是低氧反应，即当生活在低海拔地区的人移居高海拔地区时，为适应高原低氧而作出的一连串病理生理改变。其中较为突出及重要的环节就是为获得更多氧气而加速制造的血红蛋白。与其相比，大多数世居高原藏族人群却始终保持着较低的血红蛋白水平。为了揭示这一遗传变异，Beall等[5]应用全基因组关联分析法对藏族和汉族样本人群进行基因组比较，发现位于第2号染色体EPAS1/HIF-2α下游366 bp至235 kb之间的8个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)在藏族人群中更普遍，并呈现高度成对的连锁不平衡(0.23

Simonson等[10]同样比较了藏族人与低海拔亚洲人的基因数据，他们通过扫描挑选Gene Ontology和Panther数据库的活跃的基因片段(之所以扫描这些基因，是因为它们都参与了体内氧平衡传导通路的构成，或者参与进了其他被疑为在高海拔适应中的重要通路)，找到了247个先验的候选基因，再通过杂交群体扩展单体型纯合子统计法及集成单体型评分统计分析，发现共有10个基因片段显示出与高海拔低氧适应相关，其中包含Beall等[15]所识别的EPAS1/HIF-2α基因，结果提示，在每一个基因片段中至少有一种变异可能是因为高海拔环境的影响，已经历近代显著且有利的自然选择。虽然EPAS1/HIF-2α也位列在这些基因中，但此项研究并未发现其与藏族人群血红蛋白水平具有相关性。因此推测，造成此两组研究结果上的差异可能与样本数量、影响血红蛋白水平外界因素及统计学处理方法的不同有关。

Bigham等[11]调查了青藏高原藏族与安第斯山区人群基因组中近100万个SNPs，并且在这两个高海拔人群组中进行了一连串的基因组范围内的自然选择测试，在引入低海拔亚洲人群基因数据比较后发现，包含有EPAS1/HIF-2α的基因片段在青藏高原藏族和低海拔亚洲人群之间表现出显著差异，而与安第斯山人间差异不明显，从侧面反映了EPAS1/HIF-2α基因中可能存在藏族高海拔适应的遗传基础。

Yi等[12]对来自青藏高原海拔≥4300 m两个村庄的50名相互没有任何关系的藏族个体进行了外显子测序，内容包含人类基因92%的编码序列，在与来自北京的40名汉族个体(所有汉族个体几乎全部来自海拔2000 m以下，为低海拔亚洲人群样本的一部分)的外显子数据进行比较分析时发现，人群间许多SNPs在汉族中表现低频，而在藏族中表现中频，为了确定究竟哪种人群受到了自然选择的影响，小组使用藏、汉及丹麦三组之间等位基因频率成对比较的人口分支统计学方法进行分析，估测自藏汉分化后(通过两人群中同义突变位点的二维频谱估算人群历史模型，推测最初汉族可能是藏族的一个小分支，其分化时间可能在2750年以前。)频率的改变主要发生在藏族人群中，并且发现了一个来自EPAS1/HIF-2α基因的自然选择强信号，恰好位于该基因上游第6外显子内具有显著频率差异的SNP。基于三个人群频率差异，研究小组推测该基因较其他基因更早的存在于藏族人群中。随后Yi等[12]对该SNP进行了关联测试，结果显示，其与红细胞计数及血红蛋白水平存在相关性，这又一次提示在藏族高原适应中，EPAS1/HIF-2α可能有着非比寻常的作用。另外，尽管Yi等[12]的测序主要以外显子为标靶，但是一些侧翼内含子和非编码区序列也包含在内，在对其进行测序时，在EPAS1/HIF-2α序列中还意外地识别出了一个最强自然选择信号，一个位于EPAS1/HIF-2α基因中的SNP内含子，在藏(87%)汉(9%)两组之间拥有最大的等位基因频率差异。对于其功能现仍然未知，尚需进一步的研究。推测自然选择可能已直接作用于该变异，或另一联结的非编码变异来影响EPAS1/HIF-2α的表达，从而影响基因携带者的高海拔适应能力。

2 EGLN1/PHD2基因相关研究

青藏高原并非唯一一个有人类居住的高原。在世界范围内，还有许许多多高海拔地区早已遍布人类的足迹。被认为同样能够较好地适应高原环境的安第斯高原世居人群，却在高海拔适应中表现出与藏族截然相反的血红蛋白水平[13]。Bingham等[11]在对同属安第斯高原世居人群的盖丘亚族人和艾马拉人的基因进行测试，并将结果与藏族基因数据进行比较分析发现，虽然安第斯高原世居人群与青藏高原藏族世居人群在不同的基因或基因区域都表现出了积极的自然选择证据，但他们在基因适应模式上是不同的，较藏族、安第斯高原世居者中更多的染色体片段表现出对环境的积极适应(37VS34)，且这些片段相互间不存在共享，对一个预先知道在细胞氧感知中有着重要作用的EGLN1/PHD2基因的分析也同样验证了这一观点。无论是在安第斯高原人群还是在青藏高原藏族人群中，EGLN1/PHD2都表现出了积极的自然选择证据，但其在两人群间的变异是不同的。考虑到安第斯高原人群很可能早在两万年前就产生了分化，并且在伯尼吉亚和北美平原南部的安第斯高原人群先祖移民中，看起来并不享有与青藏高原藏族共同的高海拔基因。因此推测，两人群中EGLN1/PHD2的变异在他们最先进入高原地区时就已经各自发生且保留了下来。支持这一观点的进一步证据来自于小组的又一发现，即不同人群在其各自的基因组片段中拥有围绕于EGLN1/PHD2周围单一的、独特的，且具有主导性的单体型[11,14]。EGLN1/PHD2是否在某种程度上分别参与了安第斯高原人群和青藏高原藏族的高原适应策略，是一个值得探索的问题。

在印度，传统医学阿育吠陀历史源远流长沿用至今。其关于体质的概念体现了正常个体间的表型差异，包括对环境刺激的反应以及对疾病的易患性。有关体质的分类主要有三种：瓦塔、皮塔、卡法。在这三种体质当中，EGLN1/PHD2是251个区别表达基因中的一个。研究发现，EGLN1/PHD2中的普通变异rs479200(C/T)和rs480902(T/C)与高海拔适应存在相关性[15]。如rs479200(C/T)的TT基因型更频繁的出现在卡法体质中，并且与EGLN1/PHD2的高表达相关，除此而外与患者患高原肺水肿也有关系，而这个基因型却在皮塔体质中表现低频，并且不存在于高海拔当地居民当中。另有人类基因组多样性中心数据和印度基因组变异资料分析显示，在高海拔地区，不同的基因家系共享一个同样先祖的rs480902等位基因(T)，而这个基因型在皮塔体质中有较多的表现，并且在全球范围内这个基因型与海拔有关[15]。这些研究都揭示了EGLN1/PHD2基因中可能存在高原适应的遗传基础。

对我国藏族高海拔基因适应的研究中，Simonson等[10]发现的10个相关基因中的EGLN1/PHD2基因，是唯一一个同时被杂交群体扩展单体型纯合子统计法与集成单体型评分统计测试识别的。存在于该基因的变异显示出来的与血红蛋白水平的关系，也同样验证了其可能存在高海拔低氧适应的遗传基础。

3 关于EPAS1/HIF-2α与EGLN1/PHD2高海拔适应的其他研究

为了识别出藏族基因组中的高海拔适应信号，Xu等[16]对存在于藏(46例)汉(92例)两族基因组中100万个SNPs进行了等位基因频率的分析研究，在一个Fst>0.30的SNPs前0.0001%中识别出了来自EPAS1/HIF-2α的25个SNPs和来自EGLN1/PHD2的6个SNPs，这些不同的SNP位于同一区域之中，显示出了其较所期望的更大的连锁不平衡，同时也减少了单体型的多样性，这都与占主导地位的单体型和关于自然选择范围的证据相一致，而对这两种基因中占主导地位的单体型，较其他种族而言更普遍地存在于藏族中的研究发现，则更加确信了EPAS1/HIF-2α和EGLN1/PHD2基因在高原适应中的作用，在东亚，这两种基因中占主导地位的单体型频率与海拔高度也同样密切相关。

进一步有关EPAS1/HIF-2α和EGLN1/PHD2基因在藏族高海拔适应中扮演重要角色的证据来自Peng等[17]的研究，对50名随机挑选自青藏高原7个不同藏族人群的藏族人进行了SNPs分类，并把所得结果与人类基因组单体型图数据库中的数据作了对比，结果发现，EPAS1/HIF-2α基因是藏族中经历了自然选择后留下的众多基因中的一个，并且因为它是一个较早被识别出的基因，该研究对这50名藏族人中EPAS1/HIF-2α基因进行了测序，关于EPAS1/HIF-2α基因的序列分析显示，在这个区域内，超过半数的SNPs频率在藏和汉日之间有相当的差异(125个人类基因组单体型单核苷酸多态性中，69个的频率显著不同于中国北京/日本东京人群)；另外，研究发现在1334个藏族人中存在着来自EPAS1/HIF-2α的三个SNPs和来自EGLN1/PHD2的三个SNPs，以及来自PPARA的三个SNPs；研究还发现来自EPAS1/HIF-2α的三个SNPs和来自EGLN1/PHD2的一个SNP的等位基因频率显著不同于中国北京/日本东京人群，进一步证实了在EPAS1/HIF-2α及EGLN1/PHD2中存在显著的自然选择，通过序列信息估算出了一个藏汉间的分歧时间，这个时间是外显子研究所估计的6倍。

4 高原低氧适应基因研究的未来

尽管综上研究在高海拔研究领域又前进了一步，但还是始终未能找到功能性编码变异体的证据。进一步的研究应把重点放在努力阐述存在于基因序列中的基因及功能基础上，明确是否存在精确的基因相似点等。研究也将同样帮助阐明这些基因中的某些变异是否是由于低氧供所致的不适应反应。这些研究结果的意义将不仅仅限于高原病范畴，而且与临床病理学也有着密切的联系[18]。除了高海拔适应生理学及分子学方面，世居高原人群的基因研究还将为进化过程提供有价值的见解，例如了解自然选择是怎样整合协调人类生物学改变以及这种调整有多少是基于异常的或者显著的基因突变。自然选择信号的不同是否反映了人群历史的多样性等。

5 小 结

尽管对藏汉人群在历史上的分化时间各执一词，他们仍被认为拥有一共同的祖先[12,17,19-20]。所以任何两人群间基因结构的不同更可能来自各自环境中的自然选择。通过比较人群间个体变异频率或人群间区域性连锁不平衡模式及单体型多样性模式，虽然各项研究在识别这些基因信号时所使用的技术方法略有不同，但他们都不约而同地将在高海拔适应中扮演重要角色的EPAS1/HIF-2α及邻近的EGLN1/PHD2识别为自然选择的候选基因，说明了这些基因中的变异在藏族高原适应中的关键作用。

[1] Wu T,Wang X,Wei C,etal.Hemoglobin levels in Qinghai-Tibet:different effects of gender for Tibetans vs.Han[J].J Appl Physiol(1985),2005,98(2):598-604.

[2] Beall CM.Two routes to functional adaptation:Tibetan and Andean high-altitude natives[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104 Suppl 1:8655-8660.

[3] Moore LG.Human genetic adaptation to high altitude[J].High Alt Med Biol,2001,2(2):257-279.

[4] Semenza GL.Involvement of oxygen-sensing pathways in physiologic and pathologic erythropoiesis[J].Blood,2009,114(10):2015-2019.

[5] Beall CM,Cavalleri GL,Deng L,etal.Natural selection on EPAS1(HIF2alpha) associated with low hemoglobin concentration in Tibetan highlanders[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(25):11459-11464.

[6] Gale DP,Harten SK,Reid CD,etal.Autosomal dominant erythrocytosis and pulmonary arterial hypertension associated with an activating HIF2 alpha mutation[J].Blood,2008,112(3):919-921.

[7] Warnecke C,Zaborowska Z,Kurreck J,etal.Differentiating the functional role of hypoxia-inducible factor(HIF)-1alpha and HIF-2alpha(EPAS-1) by the use of RNA interference:erythropoietin is a HIF-2alpha target gene in Hep3B and Kelly cells[J].FASEB J,2004,18(12):1462-1464.

[8] Hickey MM,Lam JC,Bezman NA,etal.von Hippel-Lindau mutation in mice recapitulates Chuvash polycythemia via hypoxia-inducible factor-2alpha signaling and splenic erythropoiesis[J].J Clin Invest,2007,117(12):3879-3889.

[9] Wiesener MS,Jürgensen JS,Rosenberger C,etal.Widespread hypoxia-inducible expression of HIF-2alpha in distinct cell populations of different organs[J].FASEB J,2003,17(2):271-273.

[10] Simonson TS,Yang Y,Huff CD,etal.Genetic evidence for high-altitude adaptation in Tibet[J].Science,2010,329(5987):72-75.

[11] Bigham A,Bauchet M,Pinto D,etal.Identifying signatures of natural selection in Tibetan and Andean populations using dense genome scan data[J].PLoS Genet,2010,6(9):e1001116.

[12] Yi X,Liang Y,Huerta-Sanchez E,etal.Sequencing of 50 human exomes reveals adaptation to high altitude[J].Science,2010,329(5987):75-78.

[13] Beall CM,Brittenham GM,Strohl KP,etal.Hemoglobin concentration of high-altitude Tibetans and Bolivian Aymara[J].Am J Phys Anthropol,1998,106(3):385-400.

[14] Bigham AW,Mao X,Mei R,etal.Identifying positive selection candidate loci for high-altitude adaptation in Andean populations[J].Hum Genomics,2009,4(2):79-90.

[15] Aggarwal S,Negi S,Jha P,etal.EGLN1 involvement in high-altitude adaptation revealed through genetic analysis of extreme constitution types defined in Ayurveda[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(44):18961-18966.

[16] Xu S,Li S,Yang Y,etal.A genome-wide search for signals of high-altitude adaptation in Tibetans[J].Mol Biol Evol,2011,28(2):1003-1011.

[17] Peng Y,Yang Z,Zhang H,etal.Genetic variations in Tibetan populations and high-altitude adaptation at the Himalayas[J].Mol Biol Evol,2011,28(2):1075-1081.

[18] Majmundar AJ,Wong WJ,Simon MC.Hypoxia-inducible factors and the response to hypoxic stress[J].Mol Cell,2010,40(2):294-309.

[19] Aldenderfer M.Peopling the Tibetan plateau:insights from archaeology[J].High Alt Med Biol,2011,12(2):141-147.

[20] Brantingham PJ,Rhode D,Madsen DB Archaeology augments Tibet′s genetic history[J].Science,2010,329(5998):1467-1468.