AMP激活的蛋白激酶与压力应答

牟晓宇(综述)，李 筠，卢 玲(审校)

(中国海洋大学医药学院分子医学生物学实验室，山东 青岛 266003)

生物体在生存过程中，面对着千变万化来自环境压力的挑战，而对这些压力做出适当的应答，对于减少细胞损伤和维持细胞内稳态非常关键。研究表明，在漫长的进化过程中，细胞产生了一系列对抗环境压力的分子应答通路，如雷帕霉素靶蛋白信号通路、AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信号通路、Sirts(sirtuins)信号通路和胰岛素/胰岛素样生长因子信号通路[1]。其中，AMPK是维持细胞内稳态的一个重要参与者。AMPK作为能量感受器，能被细胞内升高的AMP激活。AMPK的激活开启了产生ATP的分解代谢途径，抑制了消耗ATP的细胞增殖和生物合成过程。自AMPK被发现以来，它在维持细胞内稳态以及调节新陈代谢等方面的作用机制被广泛研究。AMPK不仅是能量的感受器和调节器，而且还能感知各种压力并做出应答。

1 AMPK的结构

哺乳动物AMPK是由一个催化亚基(α亚基)和两个调节亚基(β和γ亚基)组成的异源三聚体。α亚基存在两种亚型(α1和α2)，β亚基存在两种亚型(β1和β2)，γ亚基存在三种亚型(γ1、γ2和γ3)。

α亚基N末端包含丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的催化结构域，其中Thr172残基对AMPK的激活起关键作用。α亚基的C末端含有与β亚基和γ亚基结合的结构域。最初认为,AMP能够通过AMPK上游激酶磷酸化其Thr172来促进AMPK的活性，然而近期更多的研究表明AMP也能够抑制蛋白磷酸酶2Cα或蛋白磷酸酶2A对Thr172的去磷酸化来激活AMPK[2-3]。AMPKα1和α2在激酶结构域有90%的氨基酸同源性，但两个α亚基表达模式和活性不尽相同。AMPKα1相对有规律的分布在心脏、肝、肾、脾、肺和大脑，而AMPKα2在骨骼肌和心脏高表达，其次是肝和肾。研究表明，内皮细胞、红细胞和血管壁主要表达AMPKα1[4-5]，提示α1亚基在心血管系统中发挥重要的作用。AMPK在能量平衡中作用的发挥主要是通过对代谢酶的快速直接的修饰(磷酸化)而实现，但是其还可以通过影响基因表达发挥长期作用。AMPKα2主要通过后者发挥作用，其大量定位于细胞核，提示当细胞中存在ATP损耗应激反应时，AMPKα2复合物的核定位可能通过磷酸化转录因子，影响相应调控能量代谢的基因表达，从而发挥能量稳定的长期调控作用。

β亚基的N末端区域包含一个糖类结合组件，它能够将AMPK靶定到糖原上。这种结合抑制了AMPK的激酶活性，因而提出了一个假说，AMPK除了感应细胞AMP/ATP比例变化及时迅速地调节能量代谢外，其同时作为糖原感知器，当机体存在大量的糖原时，通过与AMPK的糖类结合组件结合，来抑制AMPK的活性，从而调节能量稳态[6]。β亚基能够通过其C端(氨基酸186～270)结合结构域来稳定α与γ亚基的结合。γ亚基包含4个胱硫醚β合酶结构域。AMP、ADP和ATP能结合到γ亚基上，并通过改变α亚基的构象来调节AMPK的活性。

2 AMPK的调控

2.1AMPK活性调节的机制

2.1.1AMP/ATP比率调节AMPK 胞内AMP水平的升高能够激活AMPK。AMP与AMPK γ亚基的结合导致了AMPK构象的改变，使AMPK的活性上升2～5倍。这种激活的程度依赖于α和γ亚基的组成。当复合体包含α2和γ2亚型时能达到最大程度的激活；然而，当复合体中存在γ3亚型时激活程度最弱。AMP结合到γ亚基后增强了上游激酶对Thr172的磷酸化，并且抑制了蛋白磷酸酶2Cα或蛋白磷酸酶2A对Thr172的去磷酸化[2,7]。

2.1.2上游激酶对AMPK的调控 除了AMP水平能够激活AMPK，上游激酶也在很大程度上调控着AMPK。肝脏激酶B1(liver kinase B1，LKB1)和钙离子/钙调蛋白依赖的蛋白激激酶β(CaMKKβ)是已知AMPK的两个上游激酶。据报道，体外纯化的重组LKB1复合体能够直接磷酸化AMPK Thr172[8]。LKB1缺陷细胞的研究显示，CaMKKβ是另一个AMPK的上游激酶，而且AMPK被CaMKKβ激活不依赖于AMP水平的上升，而是依赖于胞内上升的钙离子浓度。此外，转换生长因子β激活的激酶1能在酵母中激活AMPK[9]，但其生理意义还有待进一步研究。

2.2生理和病理环境下AMPK的激活 许多生理和病理环境，如缺氧、热量限制和生理运动也与AMPK活性相关。在这些环境下，激活的AMPK调节着众多的下游靶点，从而使机体能够迅速适应。缺氧是整个机体或局部机体失去了足够的氧气供应的一种情况，如贫血、肺换气不足和肺部纤维瘤。缺氧能够激活AMPK已经被证实。AMPK的激活抑制了下游信号通路，主要是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白受到抑制，最终抑制了缺氧条件下的细胞增殖。除了缺氧，AMPK能够在生理运动过程中被激活。在运动中小鼠骨骼肌的AMPK被激活并促进了葡萄糖的转运，而肌肉LKB1缺陷的小鼠没有这种现象，提示LKB1对调节肌肉收缩时AMPK的活性非常重要[10]。此外，生理和病理状态下的营养耗尽，例如禁食、运动和缺血，导致了胞内AMP水平的升高，从而使AMPK被激活。

3 AMPK与氧化压力应答

氧化压力被定义为促氧化剂和抗氧化剂水平的平衡失调，从而导致大分子的损伤以及氧化还原信号传输和控制的破坏。大分子损伤往往是由于自由基氧化损伤引起，自由基可以参与由单个自由基起始的链式反应，并通过传播损伤多种分子，包括DNA、膜离子转运系统的损伤以及酶和脂质的过氧化反应。氧化损伤参与了许多心血管疾病的发生、发展。AMPK作为氧化压力的感受器和氧化还原作用的调节器，在氧化损伤相关的疾病中发挥重要作用。

3.1缺氧状态下AMPK活性的调节 缺氧能够激活AMPK，其机制复杂且依赖于缺氧的程度。早期的研究表明，缺氧抑制了脂肪酸的β氧化，从而导致ATP减少，AMP/ATP比值升高，因而激活了AMPK。然而，新近的研究证实，缺氧可不依赖细胞AMP/ATP而激活AMPK。在轻度缺氧状态下，活性氧类和活性氮对AMPK的激活发挥着重要的作用。在内皮细胞中，一氧化氮与超氧化物阴离子的产物过亚硝酸盐可以快速激活AMPK[11-12]。然而在这个过程中，胞内AMP/ATP水平保持不变，而线粒体复合体Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ的电子转移链产生的活性氧类显著增加[13-14]。AMPK对缺氧应答中缺氧诱导因子(hypoxia-induciblefactor，HIF)的诱导是必须的，而且AMPK/HIF对缺氧状态下细胞的存活和生长非常重要。但是，AMPK调节HIF的具体机制还不完全清楚。此外，在缺氧压力下，AMPK能通过自噬调控来调节细胞存活，而且这一过程不依赖于HIF-1通路。适度缺氧会引起活性氧依赖途径的AMPK活性激活，却没有引起AMP/ATP水平的明显改变[15]。

3.2氧化还原调控AMPK活性 过氧化氢会造成AMPKα和β亚基半胱氨酸残基的氧化，从而增强激酶的活性；AMPK-Cys299突变减弱了过氧化氢引起的活性，而Cys304突变使其完全失活，暗示这两个巯基参与了氧化还原对AMPK的调控[17]。AMPK的氧化修饰引起了α、β、γ异源三聚体的变构重排，因此促进了AMP调控的激酶结构域的活性。活性氮来源于过亚硝酸盐，其与AMPK的活性紧密相关。活性氮刺激AMPK磷酸化主要是通过一氧化氮调控线粒体电子转移链，从而负影响线粒体ATP产量实现的。纳摩尔级的一氧化氮可选择性和可逆性地抑制细胞色素酶C的氧化，但高浓度的活性氮可以引起半胱氨酸S-亚硝基化或酪氨酸硝化。内皮细胞中，一氧化氮是内源性的AMPK激活剂。一氧化氮通过激活可溶性鸟苷酸环化酶使钙离子水平升高，一氧化氮引起的钙离子水平的升高继而增强了CaMKKβ调节的AMPK的活性[18]。病理环境下过量过亚硝酸盐激活蛋白激酶Cζ[19]，继而磷酸化LKB1，导致了AMPK以及其下游能量贮存信号通路的激活。Nos3-/-小鼠使用AMPK激活剂二甲双胍在内皮细胞中对AMPK没有影响[20]。激活的AMPK通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶，线粒体等抑制氧化产物或通过增加抗氧化剂，如超氧歧化酶2和解偶联蛋白2的表达来维持胞内氧化还原状态。

3.3AMPK激活抑制氧化压力 不同类型的细胞或组织中，AMPKα1或α2的剔除或抑制都能加剧氧化压力。人脐静脉内皮细胞中，AMPKα1沉默下调了抗氧化防御基因(锰超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和硫氧还原蛋白)的表达[21]。与此相反，AMPK激活解除了内皮细胞的氧化压力。大量数据表明，AMPK信号通路可以通过上调内源性抗氧化基因的表达，来改善心血管疾病的氧化压力。AMPK的激活剂二甲双胍或5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(5-Aminoimidazole-4-carboxamide 1-β-D-ribonucleotide，AICAR)激活AMPK能够上调锰超氧化物歧化酶使线粒体活性氧类水平正常化，并通过AMPK-过氧化物酶体增殖物激活受体辅激活因子1α通路促进线粒体的生物合成[22]；削弱血管紧张素Ⅱ或脂多糖引起的氧化内皮损伤和即早基因活性[23]。此外，AICAR激活AMPK还能上调线粒体解偶联蛋白2[24]。

3.4AMPK调节NADPH的氧化 NADPH氧化酶(Nox)是由6种亚基构成的复合体，包括一个GTP酶(通常是Rac1或Rac2)和5个吞噬细胞氧化酶单元：gp91phox、p22phox、p40phox、p47phox和p67phox。NADPH被认为是脉管系统中活性氧类的一种重要来源，对正常血管的功能和血管疾病，如高血压、动脉粥样硬化和糖尿病有重要的作用。在人的中性粒细胞中，AICAR激活的AMPK减少了p47phox的转位和磷酸化从而抑制了佛波酯或N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸刺激的O2-。在人脐带静脉内皮细胞中，罗格列酮以一种AMPK激活依赖的方式减少高糖诱导的NADPH氧化酶调节的氧化压力。此外，在培养的足细胞中，二甲双胍通过AMPK调节的NADPH氧化酶活性的减少来抑制高糖诱导的氧化压力。AMPK2α-/-小鼠中，由于核因子κB活性的增强，NADPH氧化酶的表达和活性有显著的升高。这些发现揭示了AMPK调控NADPH氧化酶表达的新机制，并且显示了AMPK是内皮细胞中，一种生理的NADPH氧化酶和活性氧类产物的抑制物。用慢性的血管紧张素Ⅱ处理AMPKα1缺陷的小鼠，内皮功能失调并伴随着升高的NADPH氧化酶活性和Nox2的上调[15]。

4 AMPK与心血管疾病

心血管系统需要稳定的能量供应才能保证其健康运作。AMPK在生理和病理状态下都对心脏起重要作用，例如过度负荷和缺血/再灌注。近期的实验数据显示，AMPK可能也调控氧化压力应答，并且AMPK功能失调是严重心血管疾病发病机制的基础。

许多用于糖尿病和动脉粥样硬化的治疗药物，包括二甲双胍、噻唑烷二酮和他汀类，都可以通过激活AMPK来发挥它们的心血管保护作用。AMPK激活有着多种潜在的抗动脉粥样硬化作用，包括减少血管内皮炎性细胞的吸附，减少脂质的积累和炎性细胞的增殖，刺激细胞抗氧化防御基因的表达。AMPKα2剔除上调了Nox2/4的表达。上调的Nox活性导致了内皮细胞O2-产量升高，从而使内皮功能失调，进一步加剧了LDLr-/-小鼠的动脉粥样硬化[24]。AMPKα1剔除同样上调了Nox2的表达。Nox活性引起活性氧类增多，活性氧氧化肌浆/内质网钙离子ATP酶并使细胞溶质钙离子升高，从而造成内皮细胞的内质网压力。异常的内质网压力会引起内皮依赖的血管收缩受损。然而，AICAR激活的AMPK使内质网压力减缓[25]。心房颤动引起Nox2表达升高和活性增强。阿托伐他汀能抑制Rac1和Nox2的活性[26]。总体来说，AMPK能通过抑制Nox产生的活性氧类来抑制氧化损伤和线粒体功能失调。因此，AMPK对预防心血管疾病，包括心脏病、动脉粥样硬化、新生内膜生成和高血压发挥着重要的作用。

5 小结与展望

AMPK除了能对能量压力做出应答，越来越多的数据证明AMPK也可以在氧化还原失衡的情况下被激活。而并没有证据表明AMPK的激活是只直接通过半胱氨酸氧化而没有引起能量负载，还是间接地通过线粒体ATP产生机制受损。然而，以上这些发现建立起了细胞能量和氧化还原状态之间的联系。同时它们引出了AMPK对细胞进程的影响可能依赖于氧化还原的失衡，最终体现在人类病理发生上所起到的作用。AMPK除了对能量代谢做出应答，还涉及细胞凋亡、增殖和自噬等各种细胞进程。

然而，目前对AMPK的研究尚存在一些问题：①各种细胞和动物实验显示，AMPK能通过不同的机制来调控Nox的表达及表达模式，以及Nox复合体的装配和活性。AMPK的激活剂(如二甲双胍)能通过激活AMPK来抑制Nox从而发挥其心血管保护功能。但是，其他临床的AMPK激活剂，包括吡格列酮和他汀类，如何通过AMPK来发挥它们的心血管保护功能还不清楚。使用这些药物来处理Nox剔除或Nox/AMPK双剔除的动物将有利于阐明作用机制。SAMPKα1和α2亚型在N端结构域有90%的同源性，在C端结构域有60%的同源性，暗示它们可能有不同的上下游信号通路。因此，研究AMPKα亚基特异的激活剂是非常重要的。不同的心血管细胞类型和组织都具有其主要的AMPK亚型表达模式。Nox的亚细胞定位和其组成可能有不同的AMPKα亚型通过各自的分子机制来调节。

[1] Kenyon CJ.The genetics of ageing[J].Nature，2010，467(7315)：622.

[2] Sanders MJ，Grondin PO，Hegarty BD，etal.Investigating the mechanism for AMP activation of the AMP-activated protein kinase cascade[J].Biochem J，2007，403(1)：139-148.

[3] Oakhill JS，Chen ZP，Scott JW，etal.β-Subunit myristoylation is the gatekeeper for initiating metabolic stress sensing by AMP-activated protein kinase(AMPK)[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107(45)：19237-19241.

[4] Dong Y，Zhang M，Liang B，etal.Reduction of AMP-activated protein kinase α2increases endoplasmic reticulum stress and atherosclerosisin vivo[J].Circulation，2010，121(6)：792-803.

[5] Wang S，Dale GL，Song P，etal.AMPKα1 deletion shortens erythrocyte life span in mice:role of oxidative stress[J].J Biol Chem，2010，285(26)：19976-19985.

[6] McBride A，Ghilagaber S，Nikolaev A，etal.The glycogen-binding domain on the AMPK beta subunit allows the kinase to act as a glycogen sensor[J].Cell Metab，2009，9(1)：23-34.

[7] Wu Y，Song P，Xu J，etal.Activation of protein phosphatase 2A by palmitate inhibits AMP-activated protein kinase[J].J Biol Chem，2007，282(13)：9777-9788.

[8] Xie Z，Dong Y，Zhang J，etal.Identification of the serine 307 of LKB1 as a novel phosphorylation site essential for its nucleocytoplasmic transport and endothelial cell angiogenesis[J].Mol Cell Biol，2009，29(13)：3582-3596.

[9] Momcilovic M，Hong SP，Carlson M.Mammalian TAK1 activates Snf1 protein kinase in yeast and phosphorylates AMP-activated protein kinase in vitro[J].J Biol Chem，2006，281(35)：25336-25343.

[10] Sakamoto K，McCarthy A，Smith D，etal.Deficiency of LKB1 in skeletal muscle prevents AMPK activation and glucose uptake during contraction[J].EMBO J，2005，24(10)：1810-1820.

[11] Zou MH，Shi C，Cohen RA.High glucose via peroxynitrite causes tyrosine nitration and inactivation of prostacyclin synthase that is associated with thromboxane/prostaglandin H2receptor-mediated apoptosis and adhesion molecule expression in cultured human aortic endothelial cells[J].Diabetes，2002，51(1)：198-203.

[12] Zou MH，Shi C，Cohen RA.Oxidation of the zinc-thiolate complex and uncoupling of endothelial nitric oxide synthase by peroxynitrite[J].J Clin Invest，2002，109(6)：817-826.

[13] Hamanaka RB，Chandel NS.Mitochondrial reactive oxygen species regulate hypoxic signaling[J].Curr Opin Cell Biol，2009，21(6)：894-899.

[14] Laderoute KR，Amin K，Calaoagan JM，etal.5′-AMP-activated protein kinase(AMPK)is induced by low-oxygen and glucose deprivation conditions found in solid-tumor microenvironments[J].Mol Cell Biol，2006，26(14)：5336-5347.

[15] Wang S，Song P，Zou MH.AMP-activated protein kinase,stress responses and cardiovascular diseases[J].Clin Sci，2012，122(12)：555-573.

[16] Zmijewski JW，Banerjee S，Bae H，etal.Exposure to hydrogen peroxide induces oxidation and activation of AMP-activated protein kinase[J].J Biol Chem，2010，285(43)：33154-33164.

[17] Zhang J，Xie Z，Dong Y，etal.Identification of nitric oxide as an endogenous activator of the AMP-activated protein kinase in vascular endothelial cells[J].J Biol Chem，2008，283(41)：27452-27461.

[18] Xie Z，Dong Y，Zhang M，etal.Activation of protein kinase C zeta by peroxynitrite regulates LKB1-dependent AMP-activated protein kinase in cultured endothelial cells[J].J Biol Chem，2006，281(10)：6366-6375.

[19] Calvert JW，Gundewar S，Jha S，etal.Acute metformin therapy confers cardioprotection against myocardial infarction via AMPK-eNOS-mediated signaling[J].Diabetes，2008，57(3)：696-705.

[20] Colombo SL，Moncada S.AMPKα1regulates the antioxidant status of vascular endothelial cells[J].Biochem J，2009，421(2)：163-169.

[21] Kukidome D，Nishikawa T，Sonoda K，etal.Activation of AMP-activated protein kinase reduces hyperglycemia-induced mitochondrial reactive oxygen species production and promotes mitochondrial biogenesis in human umbilical vein endothelial cells[J].Diabetes，2006，55(1)：120-127.

[22] Schulz E，Dopheide J，Schuhmacher S，etal.Suppression of the JNK pathway by induction of a metabolic stress response prevents vascular injury and dysfunction[J].Circulation，2008，118(13)：1347-1357.

[23] Xie Z，Zhang J，Wu J，etal.Upregulation of mitochondrial uncoupling protein-2 by the AMP-activated protein kinase in endothelial cells attenuates oxidative stress in diabetes[J].Diabetes，2008，57(12)：3222-3230.

[24] Wang S，Zhang M，Liang B，etal.AMPKα2deletion causes aberrant expression and activation of NAD(P)H oxidase and consequent endothelial dysfunction in vivo:role of 26S proteasomes[J].Circ Res，2010，106(6)：1117-1128.

[25] Dong Y，Zhang M，Wang S，etal.Activation of AMP-activated protein kinase inhibits oxidized LDL-triggered endoplasmic reticulum stress in vivo[J].Diabetes，2010，59(6)：1386-1396.

[26] Reilly SN，Jayaram R，Nahar K，etal.Atrial sources of reactive oxygen species vary with the duration and substrate of atrialfi brillation:implications for the antiarrhythmic effect of statins[J].Circulation，2011，124(10)：1107-1117.