RNA干扰技术在端粒酶抑制剂中的应用

徐小彬(综述)，谭 晶(审校)

(昆明医科大学第二附属医院肝胆胰外科，昆明 650101)

RNA干扰是一种外源性双链RNA抑制细胞内同源基因表达的现象，通过外源性双链RNA在mRNA水平关闭相应序列及基因表达使目的基因沉默，这是一种转录后基因沉默。RNA干扰具有高效、特异、快速的特点，其在肿瘤基因治疗领域应用广泛。

端粒酶具有特殊的结构和功能，其激活与恶性肿瘤发生密切相关。端粒酶抑制剂被认为是一类潜在的高选择性的抗癌药物，抑制剂的研究为恶性肿瘤的早期诊断和基因治疗开辟了新途径。

目前以抑制端粒酶活性为靶点的恶性肿瘤治疗方案不断出现，尽管作用的环节各不相同，但都是以抑制端粒酶活性为目的。

1 端粒、端粒酶与肿瘤的关系

1.1端粒的特殊作用 端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构，其生物学作用是维持染色体稳定，保证染色体DNA完全复制，阻止遗传信息丢失，维持基因组完整，防止染色体末端彼此黏着，参与染色体在核内的空间分布。端粒长度是决定细胞增殖能力与寿命的分子标志[1]。

1.2端粒酶的活性 人端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，由人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)、人端粒酶RNA组分(human telomerase RNA，hTR)以及人端粒酶相关蛋白1(telomerase associated protein 1，TEP1)组成。端粒酶利用其自身hTR所携带的RNA为模板，在hTERT的逆转录催化下，将端粒重复序列合成到染色体末端。TEP1主要功能是调节端粒酶的活性[2]，它含有与端粒DNA互补的RNA模板，可以结合在端粒DNA上，通过使有转录活性的蛋白部分延伸，从而解决了真核细胞分裂中的末端复制问题，维持端粒的长度[3]。

1.3端粒酶与肿瘤的关系 端粒酶的激活与肿瘤的发生密切相关，在80%～90%的人原发肿瘤和肿瘤细胞系中可检测出端粒酶活性(如前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、肉瘤等)，而在正常人体组织中却无表达(除生殖细胞、一些淋巴细胞和造血干细胞外)[4]。1994年Kim等[5]利用端粒重复扩增法(telomeric repeat amplification protocol,TRAP)检测了101种肿瘤标本和100个独立的永生细胞系，发现90种肿瘤标本和98个永生细胞系中有端粒酶活性，而在良性肿瘤及正常体细胞中未发现端粒酶活性。Hiyarma等[6]采用TRAP检测胰腺癌标本的端粒酶活性，发现43例中有41例呈现阳性，而11例胰腺良性肿瘤标本均为阴性。叶远红等[7]检测胰腺癌患者胰液中的端粒酶活性，结果31例胰腺癌患者中19例端粒酶活性阳性，3例胰腺良性肿瘤患者中有1例端粒酶活性阳性，6例非胰腺疾病患者中端粒酶活性均为阴性。钟英强等[8]应用链霉亲和素-生物素复合物法(strept avidin-biotin complex,SABC)检测38例胰腺癌、25例胰腺炎、20例正常胰腺组织中hTERT的表达，结果显示正常胰腺组织及慢性胰腺炎组织中hTERT不表达。许元鸿等[9]研究的39例胰腺癌中，36例端粒酶表达阳性，11例胰腺良性病变均未检出端粒酶的阳性表达。因此，端粒酶重新激活是癌变细胞一个带有普遍性意义的生物学标志，被认为是细胞癌变的一个重要细胞生物学异常事件，是细胞永生化及肿瘤发生的关键步骤[10]。

2 RNA干扰的特点

肿瘤的发生、发展过程中伴随多种基因的异常，这些异常表达基因的蛋白产物与正常组织细胞的同类蛋白并无差异[11]，因此在蛋白水平不能很好地区分正常细胞与恶性肿瘤细胞。基因变异往往反映在mRNA水平上，这就使RNA干扰技术得以应用。

2.1RNA干扰的作用机制 RNA干扰机制的特性在于外源性双链RNA的引发及细小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)的引导干扰作用。

整个过程首先是在ATP存在的条件下，外源性双链RNA通过细胞膜进入细胞，由胞质的Dicer酶切割为21～23 bp的siRNA，随后siRNA与具有核酸内切酶活性的Argonaute2等[12]蛋白酶结合，形成RNA诱导的沉默复合物。此复合物可以把携带的双链siRNA变成单链siRNA。含单链siRNA的沉默复合物具有活性，可与目的mRNA结合，导致目的mRNA断裂、降解，从而导致目的基因沉默。

2.2RNA干扰与肿瘤的关系 肿瘤的发生、发展不但涉及原癌基因的激活，也与抑癌基因的失活密切相关。原癌基因包括肿瘤血管生成因子[13](血小板源性生长因子、表皮生长因子受体及血管内皮生长因子)、Ras相关蛋白[14]、端粒酶重要组成成分(hTERT、hTR及TEP1)等。抑癌基因包括野生型P53抑制基因、细胞周期蛋白B1调控亚基、凋亡抑制蛋白、Bcl家族促凋亡基因、浸润和转移调控基因黏着斑激酶、Ezrin蛋白、免疫抑制因子等[15-21]。理论上，肿瘤整个发生、发展过程中所涉及的基因或蛋白都可以成为RNA干扰的靶点，以此基因或蛋白设计出的siRNA可靶向沉默其表达，从而达到抑制肿瘤生长或促进细胞凋亡的目的。

3 RNA干扰与端粒酶抑制剂

端粒酶抑制剂类抗肿瘤药的设计主要以hTERT、hTR以及TEP1为对象。这一类生物制剂中，以端粒酶hTERT和hTR与肿瘤关系最为密切，也是肿瘤反义药物的主要靶点。

3.1以端粒酶hTERT为靶点的抑制剂 hTERT基因与肿瘤关系最为密切。研究表明，hTERT是调节端粒酶活性的决定性因素[22]。利用端粒酶hTERT启动子靶向基因治疗可选择性地杀死端粒酶阳性的肿瘤细胞。

丁昂等[23]研究hTERT-siRNA对人胆囊癌细胞(GBC-SD细胞)代谢、侵袭及端粒酶活性的影响时发现，抑制hTERT基因的表达可同时降低端粒酶活性。宋玉姣等[24]通过设计的Ad-VEGF-shTERT重组腺病毒质粒，能显著抑制端粒酶反转录酶的表达，通过抑制端粒酶的活性，抑制鼻咽癌CNE-2细胞增殖并诱导其凋亡。在前期试验中设计的重组质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-hTERT-siRNA通过脂质体转染胰腺癌细胞Panc-1，从体内和体外整体水平上证实了siRNA下调hTERT的表达，体现出良好的RNA干扰沉默效应，并且也证实了其对胰腺癌细胞有抑制生长、促进凋亡的作用。

腺病毒携带的质粒能方便聚集于肿瘤细胞而对正常细胞无影响，提高了病毒对肿瘤杀伤的特异性[25]。不管是腺病毒还是脂质体携带hTERT-siRNA都对正常细胞无影响，针对siRNA的多种方法携带进入细胞内而起到沉默效应，载体的选择上可能与研究的细胞系的特异性以及试验差异性有关。

3.2以端粒酶hTR为靶点抑制剂 hTR是构成端粒酶的重要结构，因此通过特异性封闭其活性区域，可以抑制hTR活性，阻断其转录或翻译过程，达到降低端粒酶的活性的目的[26]。李燕等[27]构建腺病毒Ad-hTR-siRNA可以有效、特异地抑制hTR基因表达，诱导体外培养的HeLa肿瘤细胞凋亡，具有抗肿瘤活性。李婉宜等[28]将设计的hTR-siRNA腺病毒注入宫颈癌移植瘤，发现腺病毒能够显著抑制裸鼠人宫颈癌移植瘤的生长。徐锋等[29]通过构建以hTR基因为靶点的RNA干扰装置PhTR-siRNA，检测PhTR-siRNA对BIU-87细胞的生物学效应，发现膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株的生长及端粒酶活性明显受到抑制。

3.3以端粒酶TEP1为靶点的抑制剂 端粒酶蛋白亚单位作为一种抑癌基因在肿瘤的发生、发展中起重要作用。TEP1及其蛋白抗体是构成端粒酶不可缺少的部分，破坏端粒酶蛋白亚的结构使其失活，便可抑制端粒酶活性。研究发现，TEP1与肿瘤mRNA、血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶的表达调控密切相关[30]，但是以端粒酶TEP1为靶点的研究报道较少，原因可能与尚无满意的人类端粒酶蛋白抗体有关[31]。

4 结 语

相对于其他类型的抗肿瘤药物，肿瘤对于端粒酶抑制剂类不易产生耐药性，且与传统化疗药物的细胞毒性不同，以端粒酶为靶向的药物可减少对正常细胞的毒副作用。目前研究已证实端粒酶抑制剂可与肿瘤的放、化疗协同，增加其治疗的敏感性[32-34]。端粒酶基因治疗的优势使其有望成为治疗的新方案。

并非所有肿瘤细胞端粒酶的活性都呈现高表达状态，端粒酶抑制剂对端粒酶活性较高、端粒相对较短的肿瘤细胞可能发挥更大的作用。某些癌基因家族中的多个基因往往具有同源性很高的保守序列，可以针对这些保守序列设计出特异的双链RNA，产生多个基因同时剔除的表型，理论上可以产生更大的沉默基因表达效率[35-36]。

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