食源性致病菌快速检测方法研究进展

李春梅 陶小春

广西鹿寨县疾病预防控制中心 545600

食品安全直接关系到人们的生命健康及环境安全，已成为全球各地区公共卫生的热点问题。食源性致病菌所致的食源性疾病是威胁食品安全的重要原因。传统食源性致病菌检测方法主要为分离培养、生化鉴定等，但这些方法存在特异性及灵敏度低、操作复杂费时、不能实时监控等缺点［1］，因此探索特异性灵敏度高、简捷且能实时监测与控制的检测方法成为广大研究者追求的目标。本文就近年来有关食源性致病菌快速检测方法的进展作一综述。

1 电阻抗技术

主要是通过微生物在培养基中生长代谢产生的活性底物，增加培养基的电导性，降低培养物阻抗，从而产生特征性阻抗曲线，不同细菌具有不同的阻抗曲线，因此有利于鉴定细菌。该技术特异性及灵敏性较高、操作简单、反应快，目前主要用于检测食品细菌总数、大肠杆菌、酵母菌、沙门氏菌、霉菌。有研究者［2］采用电阻抗技术检测桶装矿泉水的细菌和真菌总数，并与国标法比较，细菌检测时间由48h缩短至14.5h，真菌则有5d缩短至44h，细菌和真菌总数相符率分别为94.7%和90.4%，检测时间随样品污染程度加重而缩短。

2 微热量技术

该技术通过测定细菌生长产生热量的变化来判断是否存在细菌和鉴别其种类。通过微热量计测定细菌生长产生的热量等数据，并经过计算机处理后在记录器上绘制出热量－时间曲线图。将试验所得的热量－时间曲线图与已知细菌的热量－时间曲线图比较来判断细菌种类及数量。有报道称［3］用微热量技术通过测定痢疾杆菌产生的热量变化以评估钴化合物新药对痢疾杆菌的抑制作用，认为该方法具有较高的特异性和灵敏性，简单实用。

3 放射测量法

该法通过培养基中加入14C标记的碳水化合物或盐类的底物，细菌利用这些底物生长繁殖，代谢产生14CO2，然后用放射测量仪测量14CO2含量变化以确定有无细菌。如已加入14C标记的葡萄糖的培养基中样品存在细菌感染时，含14C的葡萄糖可被细菌摄取吸收并代谢产生14CO2，14CO2以两种形式存在：（1）在细菌体内被标记，可用放射测量仪测定14C的放射性及其强弱，确定样本中存在细菌及数量；（2）以气态14CO2释放出细菌体外，可用氢氧化季铵盐与14CO2反应获得固态或液态14C，再测定14C的放射性及其强弱以确定样本中存在细菌及数量。该法主要应用在检测血培养基中微生物。有研究者［4］使用放射测量法定量测定大肠埃希菌，其特异性敏感性均较传统方法高。

4 ELISA法

该法通过将酶系统的高效催化作用与抗原抗体免疫反应的特异性相结合的一种检测技术，可定性、定量测定抗体或抗原。可用于食品中大肠埃希菌0157、军团菌、沙门氏菌等微生物的检测。该法具有较强的特异性及较高的灵敏度，快速而稳定，容易操作等特点。韩志辉等［5］应用ELISA法测定肠炎沙门氏菌感染样本，并与国标法对照，发现两种方法符合率为97.14%。有研究者［6］通过ELISA检测系统测定生鸡肉和饲料细菌总数，用时小于27h，该法检测限为2×103cfu／25g；而传统的方法需72～96h。黄韬睿等［7］采用ELISA法测定食品中的细菌，检测限为103～104cfu／ml，整个检测时间为52h，较传统培养鉴定法检测时间明显缩短。

5 PCR技术

又称聚合酶链式反应，是一种DNA体外扩增技术，目前已广泛应用于生命科学各领域。近年来，PCR技术逐渐应用于食品中致病菌的检测。其原理是在PCR体系下细菌的核酸序列经高温、低温、适温循环被以2的指数大量复制扩增过程。李盛丰等［8］运用实时荧光实时PCR技术检测食品中单核细胞增生李斯特菌，结果表明该法检测单核细胞增生李斯特菌特异性敏感性高，简单快速。谭炳乾等［9］采用多重PCR检测食品中单核细胞增生李斯特菌，结果显示无1例假阳性。李琳等［10］采用PCR技术，以SEA－SEJ基因设计引物，对金黄色葡萄球菌进行肠毒素分型，并与传统的生化及免疫学检测法对照，结果显示PCR检测法检出率明显高于免疫学法，但与生化检测法相当，但PCR法检测时间较短仅需3h，生化检测法需5d，因此认为，PCR检测法具有速度快，可靠性高，样品量小且可以分型等优点。杨军等［11］采用多重PCR技术检测肠毒素A～E，检测仅需3～4h即可完成，且与标准的免疫检测法符合率达99%。PCR检测亦可用于水与食品痢疾杆菌的检测。目前国内外多以ipaH基因设计引物建立 PCR 检测痢疾杆菌［12，13］。

PCR检测法虽然简单、快捷、特异性高、灵敏度强，但也存在某些不足：样品纯化处理时间较长，若被少量外源性DNA污染，就可能使结果失真；选择的靶序列及引物设计不当均可降低PCR法的特异性和灵敏度；若实验条件控制不当极易使多对引物同时扩增失败或产生非特异性产物。

6 基因芯片技术

也称DNA芯片、DNA微阵列，通过原位合成的方法在支持物表面固化大量DNA探针，并与标记的样品进行杂交，通过对杂交信号的检测分析快速的鉴定生物样品［14］。该技术是一种简单快捷、敏感性高的高通量检测方法，且结果可采用自动化分析，防止因人工操作产生错误的结果，这为食品安全提供更可靠的技术支持。有研究者［15］用基因芯片与多重PCR中已生物素化的dUTP探针杂交，然后检测杂交信号鉴别出4种大肠埃希菌血清型。国外有报道［16］通过设计Ecoli 30个耐药性基因用于监测Ecoli的耐药性。Jack等［17］采用基因芯片技术联合免疫磁珠分离法检测食品中的Ecoli O157∶H7，检测限达103cfu／ml。李秀萍等［18］建立基因芯片鉴定金黄色葡萄球菌可鉴定tsst－1、sea等致病因子和mecA、aacA－aphD等抗药性决定簇，在运用PCR技术可将金黄色葡萄球菌从阴性葡萄球菌及革兰阴性菌中鉴别出来，检测时间仅需24h。AI－Khaldi等［19］采用产气荚膜梭菌ε毒素（etx）、肠毒素（epe）、β毒素（cpb）等基因编码建立基因芯片运用于产气荚膜梭菌的检测。Peng等［20］采用特异性基因芯片结合多重PCR检测贝类样品的致病性弧菌，其特异性达100%，灵敏度为102～103cfu／ml，该法能较快速准确的检测贝类食品中的致病性弧菌使用基因芯片可检测食品微生物种类和丰度，基因芯片主要为16S rRNA基因、23SrRNA基因。这两种基因功能保守，进化缓慢，分子含有保守和可变两种序列，可用于研究生物系统发育的进化过程。在16SrRNA或23SrRNA基因保守区设计PCR引物，可用多对引物扩增出多种细菌目标片断，再在可变区建立检测基因芯片，通过检测其杂交信号，从而得出样品微生物的种类和丰度。毕可然等［21］以16SrRNA、23S rRNA基因为靶序列建立基因芯片，检测大肠埃希氏菌、沙门氏菌等细菌，结果显示该芯片具有较高的特异性和灵敏度，但检测金黄色葡萄球菌特异性及灵敏性较差。李鹏等［22］以16SrRNA、23SrRNA基因序列设计基因芯片，可鉴别临床常见的病原菌。Moiler等［23］利用16SrRNA、23SrRNA 基因 芯 片技术检测水中常见致病菌，并与传统方法比较，两者相符率达95%。Ulbegi－Mohyla等［24］采用以16S rRNA、23SrRNA基因为靶分子的基因芯片检测不同贮存条件下色拉蔬菜中的致病菌，结果发现该芯片可准确检测非培养方式下复杂致病菌的组成。虽然基因芯片有很多优点，但由于该技术刚刚兴起，还存在许多不足，如样品目标物放大时易引起样品污染，使检测信噪比受到影响，降低了灵敏度；需要专门的检测设备，价格较贵；样品制备和标记无统一标准，导致不同人检测的结果可能不同。

7 生物传感器技术

该技术通过生物活性材料与待测微生物发生生物学反应，通过换能器将其中的反应信号转换成可定向处理的电信号，经放大器放大输出，从而获得待测微生物的浓度信息。生物传感器主要包括微生物传感器、酶传感器、组织传感器、免疫传感器、细胞器传感器等。该技术检测具有特异性强、灵敏度高、简单、快速便于携带等优点。一项研究［25］报道，用一种电化学生物传感器可快速而有效的测定乳制品中细菌含量。Liu Nan等［26］研制了一种双层脂质膜生物传感器结合基因芯片技术，检测金黄色葡萄球菌seb基因，灵敏度为20ng／ml。

食品安全问题与人们生命健康及社会经济发作密切相关，因此对食品中致病菌的检测有着重要的意义。随着科学技术的进步，致病菌检测方法逐渐向特异性强、灵敏度高、简单易用、经济等的方向发展，尤其是近年来出现的基因芯片及生物传感器技术，已成为微生物检测技术领域研究的热点。

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