肝细胞生长因子和低氧诱导因子1修饰间充质干细胞的应用研究进展

王 博(综述)，哈小琴(审校)

(兰州军区兰州总医院检验科，兰州 730050)

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC) 因其移植后免疫耐受性以及向炎症、损伤组织、肿瘤部位归巢的趋化特性，成为一种理想的组织工程种子细胞和基因工程载体，在缺陷性疾病、退行性疾病、遗传性疾病以及多种组织创伤修复的治疗中均具有广阔的应用前景。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)具有广泛的组织修复功能，而低氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor,HIF-1)在缺氧缺血状态下也具有保护作用。该文就HGF和HIF-1的生物活性及修饰MSC的研究现状及前景进行综述。

1 MSC的生物学特点

MSC源于中胚层，但存在于全身各结缔组织与器官的间质中，具有跨胚层分化潜能的成体干细胞，在骨髓中含量最丰富，MSC起支持和诱导造血干细胞分化的作用。虽然不同组织来源的MSC具有相似的生物学特点和表型，但是它们的分化潜能以及对来源组织的基因表达的影响方式有所不同。MSC具有以下几个生物学特点。

1.1多向分化潜能 MSC不但可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞等同胚层细胞，而且还可跨胚层分化为外胚层的神经元细胞、神经胶质细胞与内胚层的肝细胞、内皮细胞。MSC的多向分化潜能是其治疗学效应的基础。总的来说，有两种方法可用于调控MSC的分化[1]：一种为基因工程技术，通过过表达种系特异性转录因子来诱导种系特异性的MSC分化。另一种方法是通过“微环境”调控，因为MSC种系特异性的分化有赖于细胞接收到的微环境信号。在该途径中，可往MSC培养液中加入各种不同的生长因子、激素、细胞外基质成分等混合培养来诱导其分化。

1.2组成成分的生化不均一性 MSC各成分存在的生化不均一性反映了骨髓中基质系统的复杂性和他们调节组织内环境的多种不同功能，同时，这种异质性也显著影响了MSC在体内的效力。体外扩增MSC成分的不同方法可显著影响其最终的总成分构成，所以不同实验室得出的结果各不相同。其次，由于亚细胞成分各异，利用纯化细胞治疗特异性疾病存在一定的瓶颈，因此对纯化方法的研究和更新，是目前干细胞治疗应用中亟待解决的问题[2]。

1.3表面抗原的非专一性/免疫表型 用流式细胞仪检测[3]，MSC表面表达CD29、CD73、CD90、CD105、CD106、白细胞介素6、白细胞介素7和白细胞介素8等；MSC的免疫表型为主要组织相容性抗原(major histocompatibility complex,MHC)-Ⅰ(+)、MHC-Ⅱ(-)、CD40-、CD80-和CD86-。

1.4移植后免疫耐受性 MSC具有双峰性的免疫特性，既可发挥免疫抑制作用，也可发挥免疫增强作用。通过MSC介导的免疫抑制作用可治疗某些自身免疫性疾病，免疫刺激作用则可限制肿瘤的扩散。MSC的免疫表型为MHC-Ⅰ(+)，MHC-Ⅱ(-)，同时对于CD40、CD80、CD86等共刺激因子来说也是阴性的，因此MSC被认为几乎无免疫原性[4]。MHC-Ⅰ也可激活T细胞，但是在缺乏共刺激因子的情况下，无法与第二信号通路连接，从而使T细胞无反应性。已有研究表明，MSC具有调节T细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞的功能，因此MSC有望成为治疗移植物抗宿主疾病和调节炎症的有效工具之一[5]。同种异体移植的MSC不会发生排斥，并且在没有使用免疫抑制剂的情况下可以在多种不同的组织内长期存活[6]。利用MSC具有向炎症、损伤组织器官、肿瘤部位趋化等特性，目前MSC的临床应用主要有[5]：①再生治疗；②治疗移植物抗宿主反应和克罗恩病；③作为癌症基因治疗的平台/载体。此外，MSC作为抗癌药物靶向传输的载体，也越来越多地被应用于癌症的基因治疗研究。

2 HGF与MSC

2.1HGF的结构与功能 HGF是一个异二聚体，由相对分子质量为69×103的大亚基(重链)和一个相对分子质量为×103的小亚基(轻链)构成。HGF重链与轻链的氨基酸序列现已明确。HGF重链的结构包括4个Kringle结构，Kringle结构由3个二硫键连接而成的双环状多肽结构，其中特征性序列(Asn_Tyr_Cys_Arg_Asn_Pro_Asp)只存在于Kringle结构中，HGF中的Kringle结构与纤溶酶原和凝血酶中的Kringle结构相似，但与HGF功能的关系目前还不明确；HGF的轻链结构和丝氨酸蛋白酶的结构类似，但是迄今为止尚未发现HGF具有蛋白酶的功能。HGF轻链蛋白序列与散射因子都具有同源性，这与HGF的细胞运动作用相关[7]。HGF是一类作用广泛的细胞因子，除了对肝细胞的作用外，还对很多组织和细胞有调控作用，它可以启动肝再生、促进细胞分裂，对某些癌及肉瘤细胞具有抑制作用和肿瘤坏死作用[8]。

2.2HGF修饰的MSC的功能 HGF修饰骨髓MSC，可以抑制骨髓MSC凋亡，能提高细胞存活率，但是骨髓MSC也是HGF基因理想的细胞表达载体[9]。HGF修饰的MSC不会影响干细胞的分化功能，研究发现，HGF转染骨髓MSC不会影响MSC的生长及与向脂肪细胞和成骨细胞的分化能力，但对细胞增殖和成骨也没有明显促进作用[10]。此外，HGF修饰的MSC具有免疫抑制作用，将会提高移植的成功率。朱金海等[11]发现，使用HGF修饰的骨髓MSC，在肝移植中，肝的局部会出现高浓度的HGF免疫抑制微环境，它能更加显著地抑制急性排斥反应，延长移植受体的存活时间。研究表明，HGF-MSC还可以加强对经修饰的NIH3T3细胞与NIH3T3细胞的T淋巴细胞的免疫抑制作用和CD11b阳性或阴性细胞的活性，与BMSCs的免疫抑制作用类似，可以对细胞移植与组织损伤产生有益的作用。

近年来，MSC-HGF对于机体功能重建越来越受到关注。在心脏功能方面，MSC-HGF能够更好地改善心肌病心力衰竭大鼠的左心室重构，可以增强单纯MSC对心肌梗死大鼠的治疗作用，同时还可以明显改善大鼠的心肌纤维化状况[12-13]。在烧伤创面方面发现，MSC-HGF移植通过分泌相关细胞因子，能促进烧伤创面的愈合，对其具有积极影响[14]。在骨损伤方面，MSC-HGF因其更强的抗低氧损伤能力，可以增强血管的再生和骨重建，是潜在的治疗骨坏死的有效途径[15-16]。

3 HIF-1与MSC

3.1HIF-1结构和功能 HIF-1是在低氧诱导的肝细胞癌细胞株Hep3B细胞的核提取物中发现的一种蛋白质，它能与人红细胞生成素(erythropoietin,EPO)基因3′端增强子的寡核甘酸序列发生特异性结合，并促进EPO转录 ，首次将其命名为HIF-1[17]。HIF-1是异二聚体转录因子，由 HIF-1α和 HIF-1β两个亚单位组成，两个基本的螺旋-环-螺旋单元(bHLH)PAS(Per-AhR/ARNT-Sim)区域蛋白相对分子质量分别为120×103和 91×103。HIF-1广泛存在于细胞中参与低氧信号转导的一个主要的转录因子[18-19]。

HIF-1在维系肿瘤血运及供能方面起到关键的作用，不但可以诱导糖酵解相关酶的表达来改变细胞代谢途径，而且还可以诱导VEGF的表达来改善局部微循环[20]。当细胞处于低氧环境时，HIF-1α的泛素降解途径将被破坏，从而与HIF-1β二聚化形成稳定的HIF-1分子，转入到细胞核内，它通过与低氧反应元件的结合调控多种分子的表达，从而促进肿瘤细胞血管新生、糖酵解和凋亡抵抗[21]。Nardinocchi等[22]在体外实验中发现，当HIF-1α活性受到同源结构域蛋白激酶2抑制时，化疗抵抗肿瘤细胞可被致敏并出现凋亡。

3.2HIF-1修饰的MSC 低氧预处理的MSC凋亡率将降低，它对组织损伤的修复能力将会增强[23]。Weil等[24]研究表明，低氧处理后的MSC治疗损伤的胎儿肠上皮细胞时，将会增加损伤组织的增殖与生存能力。低氧培养也将会缩短细胞扩增时间，增加Sca-1+/CD44+表达，降低其分化能力[25]。目前，MSC用于治疗缺血性疾病，治疗效果不佳的瓶颈是移植后细胞的活性降低。其中，细胞的黏附性就是其生存的前提，其全部过程包括MSC黏附在内皮细胞，破坏其内皮细胞间的紧密连接使细胞裂开，细胞则通过裂口穿过其血管壁，到达缺血组织[26]。Song等[27]研究表明，在低氧条件下可提高MSC在心肌缺血性疾病中的黏附性。在血管形成的过程中，血管生成素、Ephrin、转录生长因子β、血小板源性生长因子与成纤维细胞生长因子将参与脉管系统的建立[28]。当然也有学者认为，在缺氧条件下MSC将通过HIF-1增加血管生成素1与血管内皮生长因子的表达来促进血管生成[29]。血管内皮生长因子是强有力的特异性内皮细胞分裂素，它的作用包括血管的再生，增加毛细血管的增殖及通透能力，诱导内皮细胞进入低氧组织以及无血管区域直接参与血管生成和增殖[30-31]。所以，HIF-1修饰的MSC将有效改善干细胞移植的缺点，促进增殖，降低凋亡、促进血管生成，同时提高细胞黏附能力。

4 结 语

鉴于HGF、HIF-1与MSC的密切关系，可以考虑将两者联合应用。如在心肌缺血性疾病中，HGF可以增强单纯MSC对心肌梗死大鼠的治疗作用，同时还可以显著改善大鼠的心肌纤维化状况；而低氧环境下又可提高MSC在心肌缺血性疾病中的黏附性。因此，应用HGF和HIF-1联合修饰MSC聚集了HGF的广泛修复功能、HIF-1的缺氧缺血保护功能以及MSC自身多向分化潜能及无免疫原性优势，在高原高寒环境中的再生治疗、器官移植中具有广泛的应用前景。

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