多发性硬化患者脑脊液磷酸丙糖异构酶抗体表达 与EDSS评分的相关性研究

郝烘玉，贺丹，刘辉，王婷婷

临床研究

多发性硬化患者脑脊液磷酸丙糖异构酶抗体表达 与EDSS评分的相关性研究

郝烘玉，贺丹，刘辉，王婷婷

目的探讨多发性硬化(MS)患者脑脊液磷酸丙糖异构酶(TPI)抗体表达水平与临床神经功能障碍程度的相关性及其诊断价值。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA方法)分别对23例MS患者(MS组)、17例其他中枢神经系统炎性疾病(OIND组)患者、13例非炎性疾病(ONIND组)患者的脑脊液TPI抗体表达水平进行检测及比较，并分析TPI抗体表达水平与临床扩展致残量表评分(EDSS评分)的相关性。结果MS组、OIND组、ONIND组脑脊液TPI抗体OD值表达均数分别为(0.187±0.043)、(0.195±0.042)、(0.164±0.050)，3组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。脑脊液TPI抗体表达阳性率：MS组为3例(13.04%)、OIND组及ONIND组为0(P>0.05)。相关性分析显示,MS患者临床神经功能障碍EDSS评分与脑脊液TPI抗体OD值呈正相关(r=0.938，P=0.003)。结论脑脊液TPI抗体可以作为监测MS临床疗效及评估预后的实验室指标，但目前暂不能认为其可以作为MS的辅助诊断性指标。

多发性硬化；磷酸丙糖异构酶；临床扩展致残量表评分；神经元及轴索变性

多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是由多种因素共同参与的中枢神经系统自身免疫性疾病。从早期未引起注意的轻微症状进展为特征性临床症状体征，潜伏期通常为1～10年，往往贻误诊治，因而是成年人中最常见的导致瘫痪的疾病之一。因此，早期诊断、治疗对MS预后转归至关重要。国外最新研究显示，MS患者脑脊液克隆B细胞核内含有单链可变区抗体基因片段。所表达抗体可与病变脑组织内分布于神经元及轴索内参与能量代谢的磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase，TPI)紧密结合，诱导神经元及轴索变性[1]。因此，推测TPI抗体有可能参与了MS神经元及轴索病变的过程。本研究旨在分析脑脊液TPI抗体表达与MS的相关性，为MS在神经元及轴索等灰质系统病变方面的深入研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2011年7月—2012年12月于河北医科大学第二医院住院确诊符合2010年McDonald诊断标准的MS患者23例(MS组)，男8例，女15例，年龄22～59(35.4±9.2)岁；病程1～3个月，初次确诊，以视力障碍或肢体活动障碍为主。另选取同期其他中枢神经系统炎性疾病(OIND组)患者17例，男6例，女11例，年龄22～55(36.1±10.0)岁；最终确诊为病毒性脑炎患者13例、急性脊髓炎患者4例，均未合并意识障碍。非炎性疾病(ONIND组)患者13例,其中男5例，女8例，年龄21～63(38.1±13.7)岁；最终确诊为吉兰—巴雷综合征患者1例、脑膜癌患者1例、静脉窦血栓患者2例、脑血管病患者9例。征得MS患者同意后,由本人依据量表项目对自己的生活质量进行扩展致残量表评分(EDSS评分)，视力障碍或肢体瘫痪的患者则由固定调查员协助进行。3组患者性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究均获得全部受试对象知情同意并签署知情同意书。

1.2 观测指标及方法

1.2.1 脑脊液采集：留取患者入院后但未进行激素和/或丙种球蛋白治疗前的首次腰椎穿刺术脑脊液5 ml，装入离心管中于-80℃保存待测，避免反复冻融。

1.2.2 抗体检测：采用ELISA方法检测脑脊液内TPI抗体。步骤如下：以TPI(Sigma公司)2 μg/ml包被酶标板(Nunc公司)，4℃过夜。每孔加入3%牛血清白蛋白(bovogen公司)300 μl室温条件下封闭2 h。洗板机(DG3090 南京华东电子)清洗5次，每次静置10～20 s，每孔加入CSF 35 μl 25℃孵育反应3 h。洗板机清洗5次，加入1.5%BSA/PSB配制羊抗人IgG抗体(Sigma公司)(1∶1 000)100 μl，25℃孵育反应1.5 h。洗板机清洗5次，每孔加入TBM底物，KPL单组份显色剂，25℃避光孵育反应30 min。每孔加入2 mol/L HCl终止液50 μl终止反应。酶标仪(DG5033A南京华东电子)在波长450 nm处读取吸光度值(OD值)。对3组患者分析其与EDSS评分的相关性。

1.3 判断标准 以ONIND组所测TPI抗体OD值的均数+2倍标准差为阳性判断标准，高于此标准者为TPI抗体表达阳性。

2 结 果

2.1 TPI抗体OD值及阳性率比较 MS组、OIND组、ONIND组脑脊液TPI抗体OD值表达均数分别为(0.187±0.043)、(0.195±0.042)、(0.164±0.050)，3组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。脑脊液TPI抗体表达阳性率：MS组为3例(13.04%)、OIND组及ONIND组均为0，3组间TPI抗体阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 TPI抗体与EDSS评分的相关性分析 相关性分析得出MS患者EDSS评分(3.35±2.46)与脑脊液TPI抗体OD值(0.187±0.043)呈正相关 (r=0.938，P=0.003)。

3 讨 论

3.1 脑脊液TPI抗体表达及临床价值分析 目前国际上惟一公认的用于评估MS患者神经功能障碍的评分标准为EDSS评分。EDSS评分可作为早期MS患者生活质量的一个预测因子，从而指导临床医师早期关注患者生活质量并进行必要干预[2]，具有很强的临床实用价值。本研究通过测定MS患者脑脊液TPI抗体表达水平，分析其与MS患者临床EDSS评分的相关性得出：MS患者脑脊液TPI抗体表达水平与神经功能障碍程度具有正相关性(r=0.938，P=0.003)。TPI抗体在MS组表达阳性率为13.04%，OIND及ONIND组表达阳性率为0，3组间TPI抗体表达阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。研究结果表明：TPI抗体参与诱导了MS的级联免疫反应，与MS神经元及轴索损伤密切相关。因此，脑脊液内TPI抗体的测定，可以作为监测MS临床疗效及评估预后的实验指标。在临床治疗方面，有望为抗TPI抗体相关药物的研发提供新的思路。有文献报道35例确诊MS及70例非MS患者的CSF及脑组织证实：MS患者脑脊液及病变区域脑组织内含有TPI抗体表达的增高[3]。分析TPI抗体的致病机制为：在中枢神经系统中，由于TPI广泛与神经元细胞内细胞骨架中的微管结构紧密结合[3]。在神经元中，神经微管作为神经轴突胞浆运输的主要通道，表面TPI的广泛分布为胞浆运输提供了足够的能量支持，对神经元的发育及轴突的生长具有重要作用。在中枢神经系统自身免疫性疾病中，TPI抗体可直接与神经元内与微管结构紧密结合的TPI发生免疫反应，破坏TPI的酶活性，从而造成微管结构破坏，引起神经细胞凋亡，并通过激活补体和巨噬细胞引起神经元和轴突变性[4],大量研究显示，TPI抗体表达增高现象普遍存在于多种自身免疫性疾病中，如非球形红细胞溶血性贫血、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等[5]。

然而，脑脊液TPI抗体的表达在MS与非MS疾病之间未见明显差异，提示目前尚不能认为脑脊液TPI抗体可以作为MS患者辅助诊断的特异性及敏感性指标。分析研究结果与初期预测结果不符的可能原因包括：(1)TPI广泛分布于外周及中枢神经系统，需进一步测定外周血TPI抗体表达水平，计算脑脊液与外周血TPI抗体测定差值，进行统计分析，进一步明确TPI抗体对MS的辅助诊断价值。(2)样本量较少，对MS亚型分组不明确，对于不同MS亚型脑脊液TPI抗体表达水平的差异性尚需大量样本资料进一步分析研究。

3.2 MS免疫机制研究进展 MS发病机制及临床治疗策略的研究主要是基于实验室内所制备的变态反应性脑脊髓炎动物模型。其研究结果认为，MS是一种由辅助性T1细胞(Th1细胞)介导的攻击中枢神经白质系统为主的自身免疫性脱髓鞘疾病。在此基础上产生的临床治疗机制多集中在阻止Th1细胞进入中枢神经系统或将Th1细胞转化为Th2细胞，减轻免疫炎性反应[6]。直至21世纪初期，基于MS灰质系统病变的研究成果，B细胞所参与的针对轴索和神经元的自身免疫反应在MS发病机制中的重要作用才开始得到重视。美国分子生物学专家通过研究MS患者脑脊液及尸检脑组织内由B细胞表达的免疫球蛋白重链基因片段得出结果：MS患者体内存在增殖分化的B细胞。高分化的克隆B细胞首先在进展型MS患者脑脊液内被发现，且出现时间往往早于MS脑脊液寡克隆区带的升高及异常影像学信号的形成。在MS疾病进展阶段，鞘内寡克隆免疫球蛋白合成明显增多，表明MS中枢神经系统内Th2依赖性B细胞及浆细胞的持续性增殖和分化[7]。推测TPI可能为驱动该增殖分化的相关抗原。克隆性浆细胞表达的抗体可与多数MS患者大脑神经元及轴突结合，结合部位主要包括轴膜、神经丝蛋白-L、脑衰蛋白反应性介导蛋白(CRMP)-5及神经节甘酯等[8]。病理学研究显示，MS患者脑膜内存在异位的淋巴滤泡结构，该结构生发中心内含有增生分化的B细胞、浆细胞，T细胞以及树突状细胞[4]。B细胞亚群表现出明显的VLA-4受体(淋巴细胞归巢受体)内4亚基成分的高表达[3]，在B细胞迁移穿过血脑屏障过程中发挥重要作用。多数MS患者B细胞及浆母细胞在脑实质、脑膜和脑脊液内均存在明显克隆扩增现象[9]。病理状态下，Th2细胞依赖性抗原驱动鞘内B细胞进行增殖分化形成浆细胞，由浆细胞分泌的可溶性克隆IgG抗体构成诊断MS的重要寡克隆区带[10]。MS患者脑脊液内IgG抗体表达增加以及应用抗CD-20抗体类药物如利妥昔单抗治疗的有效性均表明B细胞和浆细胞在MS的致病过程中发挥着重要作用。在此基础上，如何更好地选择性阻断或抑制MS致病过程中Th2依赖性B细胞的持续增殖分化及抗TPI抗体相关药物的研发，将有可能成为MS新的研究方向及临床治疗的新突破，为MS患者带来曙光。

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050000 石家庄，河北医科大学第二医院神经内科

贺丹，E-mail:danhe@126.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.08.026

2014-02-27)