热休克蛋白70对缺血性脑卒中的保护作用

刘 颖，章越凡，芮耀诚

(第二军医大学药学院药理学教研室，上海 200433)

脑卒中是一种常见的急性脑血管疾病，病死率和致残率高。根据流行病学研究结果显示，我国每年新发脑卒中病人>200万，每年死于脑卒中病人约150万。脑卒中分为出血性脑卒中和缺血性脑卒中，缺血性脑卒中占全部脑卒中的60%～80%[1]。随着人口老龄化不断加快，缺血性脑卒中的发病率和病死率也在不断增加[2,3]。

脑缺血后可触发体内损伤机制，如自由基的形成、炎症反应、兴奋性细胞毒性、细胞凋亡等，同时也可触发保护性机制，如抗炎细胞因子、生长因子及内源性抗氧化物的释放。热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)的形成及释放是其中非常重要的保护机制。越来越多的研究表明，在缺血性脑卒中进程中，脑组织中HSPs的表达水平直接关系到脑组织的损伤程度以及损伤的预后，因此热休克蛋白70(heat shock protein 70，Hsp70)在缺血性脑卒中进程中的保护作用也逐渐受到人们的关注。

1 HSPs家族概述

HSPs最早发现于1962年。Ritossa观察到果蝇的唾液腺在高温环境中会出现染色体蓬松现象，并且染色体具有转录活性，将这一具有转录活性的蛋白称为HSPs，热应激、炎症、缺氧、缺血、酸中毒等多种应激均能诱导HSPs的产生。根据相对分子质量大小、抗原性的差异和产物的同源性，通常将哺乳动物HSPs家族分为6类：Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40以及小相对分子质量HSPs(15～30 ku)[4]。其中研究最多是Hsp70家族。人类Hsp70家族包括至少12名成员，其中最具代表性的为Hsp70、热休克同源蛋白70(heat-shock cognate protein 70，Hsc70)、葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78，Grp78)和Hsp75。Hsp70也称Hsp72，在正常细胞中不表达或表达量较低，当遇到热应激或接触其他应激源时表达量会迅速增加，故也称为诱导型Hsp70。Hsc70是哺乳动物细胞中的一种结构蛋白质，在所有的细胞内均有表达并且在热应激条件下没有显著变化[5]，属于结构型Hsp70。上述两种HSPs具有相似的生物化学特性和高度的序列同源性。Grp78位于内质网腔内；Grp75 (Hsp75)主要位于线粒体内，这两种蛋白质具有类似的功能，在细胞内主要以分子伴侣的形式发挥作用[6]。

2 缺血性脑卒中与Hsp70表达水平

研究表明在无应激源刺激时，脑组织中的Hsp70 mRNA及Hsp70含量极低，当出现局灶或全脑缺血时，受损细胞内的变性蛋白会迅速诱导Hsp70表达。近年来，针对缺血性脑卒中后Hsp70在脑组织中表达情况的研究发现，随着缺血时间的延长，Hsp70在脑组织不同区域以及不同时间的表达量存在差异，这种差异可能决定了神经细胞能否继续维持正常的生物功能。Chen等[7]报道大鼠在脑损伤后的30 min，神经元Hsp70表达量开始增加，损伤后12 h达到峰值，损伤后1 d表达量开始减少。同时，脑缺血进程中Hsp70的表达差异与脑组织的损伤程度相关，轻度缺血性损伤可诱导神经元Hsp70 mRNA的转录和Hsp70翻译；中度缺血性损伤只诱导Hsp70 mRNA转录，但不伴翻译；较严重的缺血可抑制神经元包括Hsp70在内的几乎所有蛋白质合成，而胶质细胞和血管内皮细胞可表达Hsp70，提示Hsp70可以作为中枢神经系统细胞或组织遭受可逆性缺血损害的生物学标志[8]。

3 Hsp70在脑缺血中发挥保护作用的可能机制

已有研究表明，Hsp70在脑缺血进程中发挥着十分重要的保护作用。Ge等[9]研究发现，缺血预处理可以诱导大鼠海马CA1区Hsp70的表达，诱导生成的Hsp70可以与神经细胞再次遭受致死性缺血损伤时产生的异常蛋白质结合，减少这些具有细胞毒性的蛋白质引起的细胞凋亡。Zhan等[10]在脑缺血模型大鼠尾静脉注射重组Fv-Hsp70蛋白，可减少大鼠脑梗死体积并增强感觉运动功能，对缺血性脑卒中具有保护作用。目前认为，Hsp70在缺血性脑卒中进程中发挥保护作用可能主要通过以下几种机制。

3.1 抗氧化应激作用 机体在应激状态下生成大量氧自由基，导致脂质过氧化，影响生物膜的通透性，对细胞及溶酶体、线粒体等亚细胞器造成破坏。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶是生物体产生氧自由基的关键酶，Hsp70可以通过抑制其活性从而减少氧自由基的产生，还可提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等抗氧化酶的活性，加快氧自由基的清除[8]。Choi等[11]研究发现，Hsp70可能在转录水平或通过转录后的修饰调节SOD-1的表达，增强细胞的抗氧化应激能力。此外，Hsp70还可减少H2O2对细胞膜的损伤，减少细胞因活性氧引起的细胞毒性和细胞凋亡[8]。

3.2 抗炎及免疫增强作用 近来许多研究表明，炎症在缺血性脑损伤的发生和发展中起了重要作用[12]。在缺血导致的脑损伤中，小胶质细胞的激活被认为是中枢神经系统炎症反应的起始步骤，随后中性粒细胞、T细胞、单核细胞/巨噬细胞向缺血组织浸润，导致血脑屏障功能障碍、脑组织水肿及神经元死亡[13]。同时，损伤部位脑组织释放的核苷酸、高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1, HMGB-1)和其他内源性免疫刺激物，与小胶质细胞及其他免疫细胞结合并激活这些细胞，通过激活核转录因子κB (nuclear factorkappaB, NF-κB)、缺氧诱导因子-1 (hypoxia inducible factor-1, HIF-1)等促炎转录因子，导致多种免疫介质的上调[14]，进一步加重炎症反应。

Hsp70可通过作用于NF-κB途径发挥抑制炎症功能。NF-κB作为免疫炎症反应的核心转录因子，通常与其抑制因子(I-κB)蛋白家族成员结合形成三聚体，并以这种无活性形式存在于胞浆中。当机体遇到缺氧/缺血、组织损伤或感染等刺激时，I-κB被I-κB激酶 (I-κB kinase，IKK)磷酸化，随后被泛素结合酶识别发生泛素化，继而迅速被26s蛋白酶体降解。此时游离的NF-κB转位至细胞核内，特异性结合靶基因调控元件中的κB序列，以单独作用或与其他转录因子协同作用的方式，在白介素-1β (interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶 (inducible nitric oxide synthase，iNOS)、环氧化酶-2 (cyclooxygenase-2，COX-2)等促炎介质的转录中起了关键性调控作用[15]。研究表明，由应激引起Hsp70表达升高或Hsp70在细胞内过表达会减少炎症细胞中一氧化氮的产生以及一氧化氮合酶-2(NOS-2)的表达，同时可以减少星形胶质细胞中NF-κB的活化[16]。在缺血性脑卒中模型中，Hsp70过表达可以减少NF-κB的激活以及向细胞核的转位[17]，降低一系列免疫相关基因的转录，发挥神经保护作用。

3.3 抑制神经细胞凋亡作用

3.3.1 Hsp70可抑制线粒体凋亡通路的激活 线粒体凋亡通路被激活后，线粒体会向胞浆中释放促凋亡因子，包括细胞色素C(cytochrome C，Cyt C)、凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor，AIF)、核酸内切酶G等，Cyt C是其中重要因子之一。Cyt C进入胞浆后与凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)以及三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)结合形成凋亡体(apopto-some)，同时激活caspase-9，启动caspase级联反应，激活下游的caspase-3。活化的caspase-3进一步激活脱氧核糖核酸酶，最终导致细胞凋亡。

文献报道Hsp70通过抑制线粒体释放Cyt C，提高神经细胞在缺氧/复氧环境中的存活率[18]。Hsp70同样能与AIF结合，并抑制AIF的核移位，从而减少缺氧/缺血性脑损伤后脑细胞的死亡[19]。此外，Hsp70可直接与Apaf-1结合，减少Cyt C介导的caspase通路的激活，同时抑制Apaf-1的聚集以及Apaf-1与caspase-9前体的结合[20]。在脑缺血再灌注损伤模型中，过表达Hsp70转基因小鼠与野生型小鼠相比，线粒体Cyt C释放减少，Hsp70与Apaf-1结合增加，caspase-9的活化受到抑制，表明Hsp70对脑组织具有保护作用[21]。

3.3.2 Hsp70对Bcl-2家族的调节作用 Bcl-2和Bcl-xL是Bcl-2家族中主要的抗凋亡蛋白，具有维持线粒体外膜完整性的作用。相反，Bak和Bax等蛋白主要通过破坏线粒体膜的完整性促进细胞的凋亡。它们构成一个复杂的网络，共同调控细胞凋亡。Hsp70可以作用于激活Bax蛋白活性的通路，抑制Bax构象的改变使其无法进入线粒体，阻碍线粒体中Cyt C和AIF等促凋亡因子向胞浆的释放，抑制细胞凋亡[20]。研究发现，将Hsp70过表达之后，Bcl-2蛋白的表达升高并且稳定性增强[22]。由此可见，通过增加Hsp70的表达可以在升高Bcl-2水平的同时降低Bax对线粒体膜的损伤，减少细胞凋亡。

3.3.3 Hsp70对其他凋亡相关信号通路的调节 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)级联系统是细胞内重要的信号转导系统之一。其中，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)是MAPK家族的重要成员。Kitamura等[23]研究发现，在创伤导致的细胞凋亡过程中，JNK相关信号通路是重要途径之一，Hsp70通过多靶点对这一途径发挥抑制作用。在轻度热休克中，Hsp70通过维持胞外信号调节激酶1/2(excellular signal-regulating kinase 1/2, ERK 1/2)的稳定，抑制应激激酶p38和JNK1、JNK2的激活，对细胞发挥保护作用[24]。Bienemann等[25]也发现，Hsp70可以抑制JNK和c-JUN的活化，从而进一步减少Cyt C的释放以及caspase蛋白的激活，对神经细胞具有保护作用。

3.4 分子伴侣作用 分子伴侣是一类在序列上无相关性而功能上有相似性的蛋白质，它们在细胞内帮助新合成蛋白质或未折叠蛋白质完成正确折叠和组装，但不构成这些蛋白质最终执行功能时的组分。作为一种非特异性的细胞保护蛋白质，Hsp70是目前发现并研究较多的主要分子伴侣蛋白质之一。它以ATP依赖方式与未折叠多肽的疏水区结合以稳定其未折叠状态，促进肽链的重新折叠或正确折叠。同时，Hsp70可以与仍结合在核糖体上的新生肽链结合，防止它们过早折叠，以帮助它们跨膜运输。更重要的是，当细胞在应激源刺激下产生大量未折叠、错折叠的蛋白质时，Hsp70可帮助需要折叠的蛋白质正确折叠，同时使聚集的蛋白质解离，降低不溶性聚集物对细胞的损伤，维持细胞的正常生理功能[26]。在缺血性脑卒中进程中，Hsp70可以修复受损细胞的结构蛋白质，稳定细胞结构；并与细胞中因缺血损伤产生的异常蛋白质结合，减轻这些细胞毒性蛋白质对细胞的损害，实现对脑细胞的保护[27]。

4 结 语

Hsp70作为一种内源性保护因子，在缺氧/缺血刺激下表达增强，可减轻脑缺血对神经元的损伤，在缺血性脑卒中进程中发挥保护作用。对Hsp70在脑缺血中保护作用机制的研究，有助于找到更加有效预防以及治疗缺血性脑卒中的药物，为缺血性脑卒中保护药物的研发提供新的思路。

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