Fat－1转基因小鼠的研究进展

高 翔，李文德

(广东天然药物研究与开发重点实验室，广东医学院，广东 湛江 524023)

多不饱和脂肪酸(PUFAs)为人体必需脂肪酸，具有很重要的生理功能。其中与人体健康密切相关的PUFAs主要是n－3和n－6 PUFAs。摄入高水平的n－3 PUFAs伴有较低的n－6 PUFAs可以促进婴幼儿视网膜、大脑和神经系统的发育;降低人体心血管疾病和炎症的发生，还可以抑制体外培养的乳腺癌、肺癌、前列腺癌和结肠癌细胞［1～4］的增生，促进肿瘤细胞的凋亡。这提示n－6/n－3 PUFAs的比例对于维持细胞稳态和正常生长起着关键的作用。世界卫生组织建议，人体内正常细胞的细胞膜和细胞器n－6/n－3 PUFAs理想比例应该在1∶1到4∶1。随着社会的发展，大量的加工和养殖产品的出现，人类食用非野生动植物过量导致体内的脂肪酸比例严重的失去平衡。大部分人体内n－6/n－3 PUFAs比例可能达到10～15∶1［5］。导致这种现象的原因主要是哺乳动物生物体内缺乏合成n－3 PUFAs前体的酶，也缺乏将n－6 PUFAs转化为n－3 PUFAs的酶，使得n－6/n－3 PUFAs比例失调。大量的流行病学资料显示，饮食中的n－6/n－3 PUFAs比例过高，特别是n－3 PUFAs的缺乏，会导致机体功能障碍，引发一系列的疾病的发生(如心脑血管疾病、癌症、精神性疾病等)。为了更好地研究n－6/n－3 PUFAs比例对这类疾病的防治作用和相关机制，建立一个能排除饮食等混杂因素的干扰，并有良好的对照动物模型是非常必要的。而fat－1转基因小鼠模型的出现为研究者们提供了一个很好无干扰性因素的实验工具。

1 Fat－1转基因小鼠

2004年美国哈佛大学麻省总医院的康景轩博士实验室培育出一种能将n－6 PUFAs转化为n－3 PUFAs的转基因小鼠［6］，此小鼠携带来源于线虫(C.elegans)并表达n－3脂肪酸去饱和酶的fat－1基因，为了能在小鼠体内中表达的来自线虫(C.elegans)异源性的n－3脂肪酸去饱和酶，Kang等［7］优化了编码该蛋白质的fat－1基因的密码子并将其耦合到一个鸡的β－肌动蛋白启动子中。然后，通过显微注射方法将表达的载体导入受精卵，产生表达fat－1基因的转基因小鼠，因此，即使在缺少富含n－3的饮食的条件下，小鼠自身也可以将体内n－6 PUFAs转化为n－3 PUFAs，从而使动物的组织和器官中富含n－3 PUFAs，并且组织中的n－6/n－3 PUFAs比例趋于均衡。因此，fat－1转基因小鼠是一个研究n－3 PUFAs的生物学功能和探讨n－6/n－3 PUFAs比例在各种疾病中的作用的重要动物模型。

当fat－1转基因小鼠和同窝野生型小鼠都喂养含有高的n－6 PUFAs(主要是亚油酸，18∶2)和极低的 n－3 PUFAs(约占总脂肪的0.1%)的饮食一段时间后，两种小鼠体内的脂肪酸分布极不相同。野生型小鼠组织和器官内含有的多不饱和脂肪酸绝大多数为n－6PUFAs的亚油酸(LA，18∶2 n－6)和花生四烯酸(AA，20∶4 n－6)，几乎不含 n －3 PUFAs，与野生型小鼠比，fat－1转基因小鼠体内的n－3 PUFAs含量明显提高，其中主要包含亚麻酸(ALA，18∶3 n－3)、二十碳五烯酸(EPA，20∶5 n －3)、二十二碳五烯酸(DPA，22∶5 n－3)和二十二碳六烯酸(DHA，22∶6 n－3)，同时 n－6 PUFAs中LA和AA的含量下降，但组织的总的脂肪酸的含量不变，这表明fat－1转基因小鼠可以将体内的n－6 PUFAs转化为n－3 PUFAs，从而使它们的比值从20～50下降到约为1。这种情况可在小鼠的肌肉、母乳、血红细胞、心脏、脑、肝脏、肾脏、肺、脾脏等组织和器官中都可被检测出。另外研究还发现fat－1转基因小鼠不但非常健康，而且在繁育数代之后，它们后代小鼠的组织和器官内n－3 PUFAs高含量的现象仍然得以保留，这就表明转入的fat－1基因具有良好的遗传性和较高的生物学活性［7］。

2 Fat－1转基因小鼠的优势

与饮食补充的方法相比较，fat－1转基因动物模型的方法在改变组织中n－6/n－3 PUFAs比例方面有独特的优势。它不仅可以增加n－3 PUFAs的含量，而且还可以明显减低n－6 PUFAs的水平，从而更有效的使n－6/n－3 PUFAs比例趋于均衡，而不改变总体的脂肪酸的含量(如fat－1转基因小鼠和同窝野生型小鼠组织中n－3和n－6 PUFAs总量保持不变，但其比例已发生改变)。因此，fat－1转基因小鼠模型是改变组织中n－6/n－3 PUFAs比例的理想方法。

另外，使用fat－1小鼠模型可以减少因长期喂养(2～3月或更长)不同饲料所带来的麻烦，节省时间与金钱。在fat－1转基因小鼠体内，脂肪酸成分的改变(将n－6 PUFAs转化为n－3 PUFAs)发生早在胚胎阶段，并持续于小鼠整个寿命阶段。因此，fat－1转基因小鼠提供了一个方便的模型，用以研究在不同的年龄或时间点 n－3 PUFAs的生物学作用。

此外，fat－1转基因小鼠可以和现有疾病模型小鼠(转基因或基因敲除小鼠，如ob/ob肥胖模型，apoE－/－动脉粥样硬化模型，)进行交配，所产生的子代可用于研究n－3 PUFAs或不同n－6/n－3 PUFAs比例对疾病发生发展过程的影响。

3 Fat－1转基因鼠模型的研究现状

3.1 对神经系统的作用 神经系统中富含n－3 PUFAs，尤其是二十二碳六烯酸(DHA)。DHA是人的大脑发育、成长的重要物质之一，是神经系统细胞生长及维持的一种主要元素。它在人体大脑皮层中约占磷脂脂肪酸的40%，在神经组织中约占脂肪含量的25%。作为脑中的主要脂肪酸成分，DHA可以影响神经细胞的各种结构和功能。因此研究n－3 PUFAs对神经系统性疾病的保护机制有重要的意义。

最近利用fat－1转基因小鼠的研究表明，增加脑部的DHA可以显著增加神经细胞增殖数量，并且通过增加海马CA1区锥体神经元树突棘密度使海马区的轴突数量增多。与此同时，在Morris水迷宫测试中，与同窝野生型小鼠相比，fat－1小鼠表现出更好的空间学习能力。在体外实验进一步证明DHA可促进小鼠胚胎干细胞的增殖能力和神经分化能力。这些结果提供了直接的证据，表明DHA能促进神经发生和轴突形成并对神经细胞具有保护作用［8］。另外，Lebbadi等［9］还研究了n－3 PUFAs对阿尔茨海默病的防治作用。研究者将纯合子(ho)的三转基因阿尔茨海默病小鼠(3×Tg－AD)和杂合子(he)的fat－1转基因小鼠杂交，结果显示在20月龄时，对比3×Tg－AD小鼠，3×Tg－AD/fat－1小鼠脑内n－6/n－3 PUFAs比值增加了10%，DHA增加了6%。fat－1基因的表达也使3×Tg－AD/fat－1小鼠脑内的可溶性Aβ42减少41%，可溶性磷酸化tau蛋白下降25%，非可溶性磷酸化tau蛋白下降55%，反应星形胶质细胞活性的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)减少37%。这些结果表明增加脑内的n－6/n－3 PUFAs比例和DHA可改善AD样的神经病理学病变。同样，在慢性的中枢神经系统退行性疾病帕金森综合征的研究中，Bousquet等［10］发现，fat－1转基因小鼠虽不足已对抗1－甲基 －4－苯基 －1，2，3，6－四氢吡啶(MPTP)所造成的神经损伤，但是脑皮质的较高的DHA与黑质中的多巴胺能神经元呈正相关，不仅能增加酪氨酸羟化酶(TH)的阳性数量，也能增加多巴胺转运蛋白(DAT)和黑质的孤儿核受体(Nurr1)mRNA的表达。这足以证明DHA对帕金森的保护作用。因此，提示n－3 PUFAs是有益于阿尔茨海默病，帕金森病的预防和治疗。

3.2 对心血管系统的作用 心血管疾病是一种严重威胁人类，特别是50岁以上中老年健康的常见病。全世界每年死于心血管疾病的人数达到1500万人，居各种死因的首位。目前心血管疾病已经成为危害人类健康的“头号无声杀手”［11］。有大量研究证实n－3 PUFAs有助于预防心血管疾病的发生，还能对某些心血管疾病(特别是动脉粥样硬化)起到治疗作用。但是，通过饮食补充n－3PUFAs来研究其对心血管疾病(特别是动脉粥样硬化)的影响，存在着一定干扰因素。因此，Wan等人［12］将模拟动脉粥样硬化apoE－/－模型小鼠和 fat－1转基因小鼠杂交培育出apoE－/－/fat－1 双转基因小鼠。相比较 apoE－/－小鼠，双转基因小鼠主动脉病变面积显著性地降低了6.32%。但是，除血清中较高的甘油三酯外，双转基因小鼠血清中的胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白的水平与apoE－/－小鼠没有显著性差异。进一步发现，双转基因小鼠体内前列腺素E2(PGE2)、细胞间粘附分子－1、单核细胞趋化蛋白 －1、白细胞介6(IL－6)和环氧合酶－2(COX－2)表达减少。这表明体内高含量的n－3 PUFAs有抗动脉粥样硬化的作用，其作用机制可能与其抗炎作用密切相关。

3.3 抗癌作用 研究发现，在肿瘤细胞中n－6/n－3 PUFAs的比值远远高于正常水平。体内n－6/n－3 PUFAs比例的失调，会导致乳腺癌、结肠癌、肝癌等癌症发生。目前研究者对于fat－1基因抗肿瘤的作用有了初步的认识，但是其抗肿瘤的机制现还不是很清楚。为了探讨n－6/n－3 PUFAs比例与肿瘤发生之间的关系，Xia等［13］将小鼠黑色素瘤B16细胞植入fat－1转基因小鼠和同窝野生型小鼠(wt)体内，观察两种小鼠的肿瘤的形成和成长速率，与wt小鼠相比，fat－1小鼠体内黑色素瘤形成和发展都显著减慢，而且肿瘤和周边的组织中均含有较高的n－3 PUFAs及其代谢产物PGE3，此外，肿瘤抑制因子PTEN基因也显著上调。体外细胞培养发现，n－3 PUFAs的抗肿瘤机制可能是通过增加PGE3来激活PTEN通路。另一方面的研究发现，结肠组织的n－3 PUFAs能有效的预防结肠肿瘤的发生。Nowak等［14］在用炎症物质(葡聚糖硫酸钠)和致癌物质(氧化偶氮甲烷)诱导结肠肿瘤发生的过程中，发现fat－1转基因小鼠的结肠肿瘤的发生和生长率都有所下降，并伴有活性较低的NF－kB、iNOS和较高水平的 TGF－β。Jia等［15］还发现，n－3 PUFAs可降低CD3+T细胞，CD4+T辅助细胞和肠道内巨噬细胞的数量，这表明n－3 PUFAs可通过降低炎症来抑制结肠癌的发生。为了确定n－6/n－3 PUFAs比例对前列腺癌的影响，Berquin等［16］将fat－1小鼠和前列腺特异性Pten基因敲除小鼠(一种前列腺癌模型)杂交培育出Pten基因敲除+fat－1双转基因小鼠，发现相对Pten基因敲除小鼠，双转基因小鼠可显著性的降低肿瘤生长率和增加小鼠的存活率，而且还可减少磷酸化的细胞凋亡因子Bad的比例。同样，在fat－1小鼠中观察到，n－3 PUFAs可以促进乳腺的分化来降低乳腺癌的发生的风险［17］。还有研究发现，DHA能上调配体蛋白聚糖－1(SDC－1)来抑制MEK/Erk/Bad信号通路从而诱导乳腺癌细胞的凋亡［18］。

3.4 抗骨质疏松作用 骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是以骨量减少、骨组织显微结构退化为特征，以致骨的脆性增高及骨折危险性增加的一种全身骨病。OP多发于老年人群，与其相关的骨折是导致死亡或丧失活动能力的主要原因［19］。个体骨量是由饮食、身体活动、遗传因素等共同决定的。近年越来越多的研究提示饮食因素中PUFA对骨骼健康有重要的影响。其中研究报道n－3 PUFAs有防治骨丢失中的作用。

Rahman等［20］研究喂养含10%半纯化AIN－93M饮食后的fat－1转基因小鼠、野生型小鼠、去卵巢fat－1转基因小鼠及去卵巢野生小鼠之间骨密度的差异，发现，与去卵巢的wt小鼠比较，去卵巢fat－1转基因小鼠可降低NF－kB配体受体激活因子(RANKL)和血清中的碱性磷酸酶，增加股骨远端，胫骨近端，股骨中段的骨密度。体外实验显示，去卵巢的wt小鼠，去卵巢fat－1转基因小鼠的骨髓细胞在LPS刺激下，后者体内的促炎因子 TNF－α、IL－1β、IL－6显著降低，而抗炎因子IL－10、干扰素－2、NO显著提高，并且降低了环氧化酶－2和NF－kB的活性。这提示omega－6/omega－3的低比例可产生抗炎作用来防治去卵巢小鼠骨密度的丢失。随后，Banu等［21］也研究了 n－3 PUFAs对去卵巢小鼠的骨质影响情况，发现野生型小鼠在去卵巢手术后，在股骨末梢、股骨颈、近端胫骨及第四腰椎有显著骨质丢失;而去卵巢的fat－1小鼠在上述部位没有观察到明显的骨质丢失。这表明，n－3 PUFAs可以减轻去卵巢术诱导的多个部位骨质丢失，其中最主要的是减少骨内皮质表面的骨吸收。

4 展望

n－3 PUFAs具有抗炎，缓解动脉粥样硬化等抗心血管疾病，抑制肿瘤的发生和癌细胞的生长繁殖和迁移的作用;还与人类多种神经性疾病有关，可改善阿尔茨海默病和帕金森综合征的症状;此外还能预防骨质疏松症的骨量的丢失。鉴于n－3 PUFAs对多种疾病均有防御和治疗作用，更深入的研究其与疾病之间的作用机制显得更为重要。而fat－1转基因小鼠模型在研究过程中有着不可替代的先天优势，该模型小鼠以及它与其他基因改造的各种疾病模型小鼠杂交的后代，将为进一步揭示n－3 PUFAs的药理作用及其分子机制提供重要基础平台。fat－1小鼠必将更广泛地应用到PUFAs与疾病关系的研究中。

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